五糧液酒醅中芽孢桿菌的分離鑒定及其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì).pdf

1、傳統(tǒng)白酒釀造過程中，以酒曲為發(fā)酵劑的酒醅中含有種類豐富的微生物，這些微生物除引起乙醇發(fā)酵和產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)外，有的也產(chǎn)生其他重要的功能性物質(zhì)。基于酒醅中含有大量芽孢桿菌的現(xiàn)象，本論文從著名白酒產(chǎn)品五糧液酒醅中采取樣品，分離其中的芽孢桿菌，篩選具有抑菌活性的菌株，進(jìn)而分析產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的本質(zhì)，確定其抑菌譜、抑菌基因等生物和理化特性。
　　通過通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)等常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)從酒醅樣品中分理出芽孢桿菌125株，以黑曲霉作為指示菌

2、，經(jīng)抑菌試驗(yàn)篩選出一株抑菌活性明顯的解淀粉芽孢桿菌，命名為解淀粉芽孢桿菌WY047(Bacillus amyloliquefaciens WY047)。進(jìn)一步抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株有廣譜抑菌活性，除對(duì)真菌有明顯抑制作用外，對(duì)部分革蘭氏染色陽性細(xì)菌、革蘭氏染色陰性細(xì)菌也具有抑菌作用。
　　通過PCR擴(kuò)增，從芽孢桿菌WY047中檢測(cè)出bmyD、fenA、hag、ituA、mrsA和tasA等抑菌物質(zhì)基因，表明該菌株可能產(chǎn)生桿菌抗霉素（b

3、acillomycin D）、芬薺素（fengycin）、鞭毛蛋白（flagellin）、伊枯草菌素（iturin A）、美殺菌素（mersacidin）、TasA蛋白等相對(duì)應(yīng)的抑菌物質(zhì)。
　　為分離鑒定解淀粉芽孢桿菌WY047發(fā)酵液中抑菌蛋白，發(fā)酵液上清中的蛋白經(jīng)飽和硫酸銨沉淀后，所得蛋白粗提物通過葡聚糖凝膠層析和陰離子色譜柱進(jìn)一步純化，采用SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)具有抑菌活性的峰1的洗脫液呈現(xiàn)單一條帶，對(duì)此條帶切膠回收

4、后使用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，確定該蛋白是鞭毛蛋白（flagellin），分子量為35207 Da。由于TasA產(chǎn)生于孢子分化的過渡期蛋白，此試驗(yàn)中沒有成功分離得到。
　　為分離鑒定解淀粉芽孢桿菌WY047發(fā)酵液中抑菌肽，解淀粉芽孢桿菌WY047的上清液經(jīng)鹽酸沉淀后得到，所得脂肽粗提物經(jīng)半制備C18反相高效液相色譜分離后，由HPLC/UV-MS液質(zhì)聯(lián)用儀器測(cè)定每一個(gè)組分的核質(zhì)比，發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生桿菌抗霉素（bacillo

5、mycin D）、芬薺素（fengycin）、伊枯草菌素（iturin A）、美殺菌素（mersacidin）等多肽。
　　菌株培養(yǎng)后經(jīng)離心除菌提取發(fā)酵液粗提物，以黑曲霉為指示菌，測(cè)定發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)對(duì)熱、酸、堿、酶及有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性。表明粗提物具有一定的熱穩(wěn)定性，對(duì)酸堿不敏感，在胰蛋白酶、胃蛋白酶、α-淀粉酶的作用下依然保持抑菌活性，對(duì)甲醇、乙醇、乙腈等有機(jī)溶劑具有穩(wěn)定性。
　　為檢測(cè)上述抑菌基因在芽孢桿菌中的分布，對(duì)80

6、株芽孢桿菌進(jìn)行了測(cè)定。其中擁有hag基因的菌株為61株，擁有fenA基因的菌株為52株，擁有ituA基因的菌株為45株，擁有bmyD基因的菌株為41株，而mrs基因在芽孢桿菌中的分布最少，僅在11株芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn) mrs基因。同時(shí) hag-fenA-ituA和hag-fenA-bmyD的組合基因在所測(cè)定的芽孢桿菌中最常見，分別在40株和34株芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)這兩種基因組合。同時(shí)，一株芽孢桿菌中分布有4種抑菌基因的菌株最多，在31株芽孢桿菌