基于非天然氨基酸插入法構(gòu)建針對(duì)自體硬化蛋白的骨質(zhì)疏松疫苗.pdf

1、【背景】
　　骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, OP)是一種主要表現(xiàn)為骨骼骨量的減少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致骨組織的脆性增加、骨骼強(qiáng)度的降低而易于發(fā)生骨折的全身性骨代謝障礙性疾病，多發(fā)生在老年和絕經(jīng)后的女性。正常骨組織形態(tài)的維持主要取決于兩個(gè)方面：成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞所發(fā)揮的成骨作用和骨吸收作用。這種耦聯(lián)機(jī)制一旦被打破，就會(huì)引起許多骨代謝相關(guān)性疾病。而在引起成骨作用和骨吸收作用耦聯(lián)失衡的諸多因素中，成骨細(xì)胞功能的減弱扮

2、演者及其重要的角色。
　　骨硬化蛋白(Sclerostin)是由 SOST基因調(diào)控，主要表達(dá)于骨細(xì)胞。骨硬化蛋白作用于成骨細(xì)胞表面的低密度脂蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合受體( LRP5/6)，從而拮抗成骨細(xì)胞胞內(nèi)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而對(duì)成骨細(xì)胞的功能發(fā)揮明顯的負(fù)性調(diào)控作用?？构怯不鞍椎膯慰寺】贵w通過(guò)與骨硬化蛋白特異性結(jié)合，進(jìn)而特異性拮抗骨硬化蛋白對(duì)成骨細(xì)胞的負(fù)性調(diào)控作用，從而明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成作用，因此對(duì)骨代謝相關(guān)性疾病均有良好的治

3、療作用。但抗骨硬化蛋白單克隆抗體的制備工藝復(fù)雜，成本昂貴及抗體部分的不良反應(yīng)限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。而疫苗作為主動(dòng)免疫,通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性針對(duì)內(nèi)源性抗原的多克隆抗體也許是一個(gè)更好的策略。在主動(dòng)免疫治療中，疫苗能否突破自體蛋白的免疫耐受，并產(chǎn)生能特異性高親和力結(jié)合自身蛋白抗原的抗體是其主要難點(diǎn)。本研究中，我們通過(guò)在骨硬化蛋白特定位點(diǎn)插入非天然氨基酸，從而有效突破了自體蛋白的免疫耐受，產(chǎn)生的高滴度抗體不僅能與突變型骨硬化蛋白結(jié)合，同時(shí)與

4、內(nèi)源性骨硬化蛋白也具有良好的交叉反應(yīng)。
　　本研究探討了小鼠非天然氨基酸突變型骨硬化蛋白的原核表達(dá)和純化，以及將其作為疫苗檢測(cè)非天然氨基酸突變型骨硬化蛋白疫苗在小鼠骨質(zhì)疏松模型(OVX)中的療效與可行性，為進(jìn)一步優(yōu)化疫苗治療骨質(zhì)疏松癥奠定了基礎(chǔ)。
　　【方法和結(jié)果】
　　1.將經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后的小鼠mSOST基因，構(gòu)建 pET28a-mSOST重組表達(dá)載體，然后分別將編碼第115,121和126位氨基酸的密碼子（AAC

5、, AAG和AAC）定點(diǎn)突變?yōu)殓昝艽a子(TAG)，在pEVOL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的情況下，編碼p-硝基苯丙氨酸，然后將構(gòu)建成功的pET28a-pNO2Phe mSOST重組表達(dá)載體送公司進(jìn)行雙向測(cè)序鑒定。
　　2.野生型和 p硝基苯丙氨酸突變型骨硬化蛋白的表達(dá)和純化。誘導(dǎo)表達(dá)的菌體經(jīng)裂解后進(jìn)行SDS-PAGE與 Western Blot檢測(cè)，結(jié)果表明，p硝基苯丙氨酸突變型骨硬化蛋白在原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)成功表達(dá)。通過(guò)Ni-NTA親和層析介

6、質(zhì)對(duì)骨硬化蛋白進(jìn)行純化，純化后的骨硬化蛋白用超濾管進(jìn)行蛋白濃縮。將濃縮后的骨硬化蛋白進(jìn)行高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)。結(jié)果表明，野生型骨硬化蛋白在特定位點(diǎn)成功插入了p-硝基苯丙氨酸。
　　3.以純化的野生型和p硝基苯丙氨酸突變型骨硬化蛋白免疫C57/BL雌性小鼠，最后一次免疫結(jié)束后第7天尾靜脈取血，靜置，去上層血清?？寡寤钚杂每寡搴凸怯不鞍椎慕Y(jié)合實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。而血清抗體滴度的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，突變型骨硬化蛋白能突

7、破自身免疫耐受產(chǎn)生高滴度，高特異性抗體，該抗體不僅能與突變型骨硬化蛋白相結(jié)合，同時(shí)與內(nèi)源性骨硬化蛋白也具有良好的交叉反應(yīng)。
　　4.驗(yàn)證突變型骨硬化蛋白疫苗對(duì)骨質(zhì)疏松模型小鼠的治療效應(yīng)。通過(guò) ELISA檢測(cè)評(píng)估整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程抗體滴度情況；通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)（骨鈣素）骨形成情況以及顯微 CT技術(shù)檢測(cè)骨密度、骨微架構(gòu)等。結(jié)果顯示非天然氨基酸突變型骨硬化蛋白疫苗對(duì)OVX模型小鼠骨質(zhì)疏松有明顯的治療效果。
　　【結(jié)論】
　　本實(shí)驗(yàn)中

8、，我們首次表達(dá)和純化了小鼠 p-硝基苯丙氨酸突變型骨硬化蛋白，并通過(guò)高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)驗(yàn)證了野生型骨硬化蛋白特定位點(diǎn)（115,121和126）成功插入了p-硝基苯丙氨酸。然后將突變后的骨硬化蛋白免疫小鼠，檢測(cè)小鼠抗血清的活性，發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生的抗體與內(nèi)源性骨硬化蛋白有良好的交叉反應(yīng)。然后將純化的p-硝基苯丙氨酸突變型骨硬化蛋白作為疫苗，并在骨質(zhì)疏松癥模型(OVX)小鼠上驗(yàn)證其治療效果。對(duì)小鼠血清成骨標(biāo)志物以及micro-CT檢測(cè)，非天