耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶的篩選與應(yīng)用研究.pdf

1、葡萄糖異構(gòu)酶(glucose isomerase，GI)可將D-葡萄糖異構(gòu)化為D-果糖，獲得的高果糖漿（high fructose corn syrup，HFCS）作為甜昧劑可應(yīng)用于食品等諸多領(lǐng)域。根據(jù)果糖含量的不同，高果糖漿可分為HFCS-42、HFCS-55和HFCS-90。其中，HFCS-55的甜度優(yōu)于蔗糖，是市場上的主流產(chǎn)品。但是，目前的商業(yè)化GI只能生產(chǎn)HFCS-42，需要經(jīng)過色譜分離濃縮獲得HFCS-90，然后經(jīng)勾兌等步驟才

2、能獲得HFCS-55。為了實現(xiàn)一步生物轉(zhuǎn)化法制備HFCS-55，本論文開展了以下研究:
　　挖掘新型耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶的基因。以嗜熱葡萄糖異構(gòu)酶Thermotoga maritima GI(TmGI)氨基酸序列為模板，在NCBI中進行BLAST，選取具有高同源性、未被研究的Thermoanaero bacterium xylanolyticum GI(TxGI)、Thermus oshimai GI(ToGI)、Geobacill

3、us thermocatenulatus GI(GtGI)和Thermoanaerobacter siderophilus GI(TsGI),進行全基因合成、重組質(zhì)粒的構(gòu)建，實現(xiàn)其在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中的成功表達。通過酶活測定，ToGI和TsGI重組菌的酶活分別為2.42和2.54U/(mg·total protein)，高于TxGI和GtGI重組菌，因此，最終選擇ToGI和TsGI為研究對象進行后續(xù)研究。

4、　　ToGI和TsGI的純化與酶學性質(zhì)研究。收集發(fā)酵的菌體，經(jīng)細胞破碎、熱處理去除雜蛋白和nickel-NTA柱親和層析，獲得純化的酶蛋白。酶學性質(zhì)研究表明，Mn2+和Mg2+分別對ToGI和TsGI酶活有最大促進作用;ToGI的最適反應(yīng)溫度為95℃，優(yōu)于TsGI的90℃;ToGI添加20mM Mn2+，于85℃保溫48h，仍保持80％初始酶活，該結(jié)果明顯優(yōu)于TsGI和已報道的耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶催化劑;兩酶的最適反應(yīng)pH分別為8.0和6

5、.5;ToGI和TsGI對D-葡萄糖的Km分別為81.46mM和199.03mM，表明ToGI具有較好的底物親和力。ToGI的kcat/Km值為21.77min-1·mM-1，高于TsGI的14.54min-1·mM-1，表明ToGI比TsGI具有更高的催化效率。綜上所述，選擇熱穩(wěn)定更好、催化效率更高的ToGI開展下一步研究。
　　重組菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/ToGI發(fā)酵產(chǎn)酶條件與轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化。通過優(yōu)化實

6、驗，確定ToGI重組菌的最佳產(chǎn)酶條件為誘導溫度28℃、誘導劑(IPTG)終濃度0.1mM、發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5mM Mn2+;將最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系放大100mL，包括20g/L濕菌體、添加10mM Mn2+和200g/L底物，于95℃和pH7.5條件下轉(zhuǎn)化4h，D-果糖產(chǎn)率高達57.34％。對ToGI進行同源建模和分子對接，經(jīng)過理性分析，選擇對影響酶活的關(guān)鍵位點進行定點突變，具體為:Trp136Phe、Glu216Asp、Thr352Asp、L

7、eu342Ile、Val228Cys。最終，Val228Cys和Thr352Asp突變后活力有略微提高，分別為初始酶活的107％和104％。
　　通過上述研究，本研究篩選到新型耐高溫葡萄糖異構(gòu)酶ToGI，與現(xiàn)有和報道的耐熱酶相比，具有更為突出的熱穩(wěn)定性;運用最優(yōu)菌體發(fā)酵與轉(zhuǎn)化條件，實現(xiàn)了一步生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)HFCS-55，該工藝可簡化后續(xù)濃縮分離步驟，有助于節(jié)能降耗;通過蛋白質(zhì)工程手段，初步發(fā)現(xiàn)了對酶活影響較大的關(guān)鍵氨基酸位點，為后