海洋球石藻病毒參與宿主新型鞘脂類合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆及其功能分析.pdf

1、鞘脂類是目前脂類研究的熱點(diǎn)之一，作為食物中的一種天然成分，鞘脂可以歸為食物中的“功能成分”。海洋球石藻（Emiliania huxleyi）是一種海洋真核浮游植物，能夠產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝生物活性物質(zhì)。特別是該藻被特異性病毒(E.huxleyi virus:EhV)感染后能夠合成一系列具有特殊結(jié)構(gòu)的新型鞘脂類活性物質(zhì)，這些鞘脂類有望開發(fā)為新型的天然食品和醫(yī)藥資源。EhV86及其宿主EhCCMP1516全基因組測(cè)序注釋結(jié)果顯示，EhV86基

2、因組中存在7個(gè)預(yù)測(cè)編碼鞘脂類合成途徑(SBP)關(guān)鍵催化酶的基因，包括絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)、長(zhǎng)壽保障基因類蛋白(LAG1)、脂肪酸去飽和酶(FAD)、酯類磷酸酶(LPP)、甾醇去飽和酶(SD)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)及跨膜脂肪酸伸長(zhǎng)蛋白(TFAE)。正是病毒基因組編碼的這些酶在一定程度上掌控著宿主藻細(xì)胞鞘脂類的代謝，從而合成并積累宿主新型的鞘脂類物質(zhì)。到目前為止，上述幾種酶中只有SPT功能和生化特性進(jìn)行了初步研究，其他幾種鞘脂類代謝途

3、徑中酶的功能和確切位置還有待確定。本論文選擇其中兩種關(guān)鍵酶，即SD和FAD為研究對(duì)象，從海洋球石藻病毒EhV99B1基因組中克隆獲得該兩種酶基因，對(duì)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析;然后通過基因工程技術(shù)初步分析這兩種酶在酵母細(xì)胞鞘脂類代謝途徑中可能的作用;對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已建立的海洋球石藻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)。為進(jìn)一步構(gòu)建海洋球石藻生物反應(yīng)器、合成積累新型鞘脂類資源提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)應(yīng)用PC

4、R技術(shù)從球石藻病毒EhV99B1基因組中擴(kuò)增獲得上述兩種酶基因。其中甾醇去飽和酶SD基因全長(zhǎng)987bp，編碼328個(gè)氨基酸，該蛋白的理論等電點(diǎn)為8.31，分子量為37.83kDa，為疏水性、不穩(wěn)定蛋白，存在6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，不存在信號(hào)肽;其二級(jí)結(jié)構(gòu)中螺旋含量最多。脂肪酸去飽和酶FAD基因全長(zhǎng)963bp，編碼320個(gè)氨基酸，該蛋白的理論等電點(diǎn)為7.26，分子量為37.67kDa，屬于親水性、穩(wěn)定蛋白，存在4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，不存在信號(hào)肽;其二級(jí)

5、結(jié)構(gòu)中也是螺旋結(jié)構(gòu)含量最多。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，病毒這兩種基因與宿主球石藻及金色藻屬親緣關(guān)系較近。
　　(2)構(gòu)建了釀酒酵母重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD和pYES2/CT-FAD，通過醋酸鋰的方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株INVSc1，對(duì)篩選獲得的陽(yáng)性菌株用D-半乳糖誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)，其分子量分別為甾醇去飽和酶SD為37.8kDa，脂肪酸去飽和酶FAD為37.6kDa。重組酵母細(xì)胞與原始酵母細(xì)胞

6、的總脂薄層層析結(jié)果有較大的差別，表明病毒甾醇去飽和酶SD和脂肪酸去飽和酶FAD能夠改變酵母細(xì)胞中脂類組成及含量變化，具有一定的催化活性。
　　(3)利用基因工程技術(shù)從pBar、pGFP質(zhì)粒和E.huxleyi BOF92基因組中成功克隆了海洋球石藻內(nèi)源性啟動(dòng)子FCP-P基因，終止子FCP-T基因、草銨膦抗生素抗性基因Bar、綠色熒光蛋白基因GFP。以psp73作為基礎(chǔ)載體，利用不同酶切位點(diǎn)成功構(gòu)建了pEhux-Ⅰ（psp73-FA

7、P-Bar-FAT1-FBP-FAT2）載體和pEhux-Ⅱ（psp73-FAP-GFP-FAT2）載體;采用PEG介導(dǎo)的方法將兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)化海洋球石藻BOF92細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察到部分轉(zhuǎn)化細(xì)胞中綠色熒光蛋白基因的表達(dá)，通過草銨膦篩選獲得成功轉(zhuǎn)化的藻細(xì)胞株;實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western bloting檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化細(xì)胞中Bar基因的穩(wěn)定表達(dá)。
　　以上研究結(jié)果初步確定了病毒兩種酶基因表達(dá)產(chǎn)物具有一定的催化活性，優(yōu)化后的