我國(guó)設(shè)施辣椒中主要鐮刀菌致伏馬毒污染的發(fā)生規(guī)律與產(chǎn)毒分子機(jī)理研究.pdf

1、設(shè)施辣椒是我國(guó)特種優(yōu)勢(shì)農(nóng)產(chǎn)品，占膳食消費(fèi)比重也越來(lái)越大。國(guó)內(nèi)關(guān)于其真菌毒素污染的相關(guān)基礎(chǔ)研究很少，給食品安全及相關(guān)產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重隱患。伏馬毒素是鐮刀菌次級(jí)代謝產(chǎn)生的一種真菌毒素。伏馬毒素可降低農(nóng)作物的生產(chǎn)性能、損傷動(dòng)物和人的免疫系統(tǒng)、干擾鞘脂代謝，對(duì)人和動(dòng)物健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。以往研究表明：伏馬毒素對(duì)設(shè)施辣椒的污染在國(guó)外比較普遍。
　　為了明確我國(guó)設(shè)施辣椒中伏馬毒素的污染狀況和發(fā)生規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)在全國(guó)范圍內(nèi)采集了34個(gè)城市的設(shè)施辣椒樣本

2、，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行菌種分離鑒定，確定了我國(guó)設(shè)施辣椒的主要致病鐮刀菌種類(lèi)，進(jìn)而研究不同致病鐮刀菌產(chǎn)伏馬毒素的規(guī)律，最后對(duì)茄腐鐮刀菌產(chǎn)伏馬毒素的分子機(jī)制進(jìn)行探究。
　　1、從全國(guó)34個(gè)城市地區(qū)采集了腐爛和健康的設(shè)施辣椒樣本900份，采用組織分離的方法對(duì)青椒樣本的發(fā)病部位和健康部位的鐮刀菌進(jìn)行分離和純化，共分離到277株鐮刀菌。運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)分離到的鐮刀菌進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定主要通過(guò)觀察菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、顏色、大小等，并結(jié)

3、合菌絲的形態(tài)和分身孢子的有無(wú)及其特點(diǎn)等特征進(jìn)行種屬的鑒定。分子鑒定采用真菌的通用型引物Internal Transscribed(ITS)和鐮刀菌的特異性引物Elongation factor1-α( EF-1α)對(duì)菌株的序列擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析。形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定獲得污染我國(guó)設(shè)施辣椒的鐮刀菌45株，分屬8個(gè)種。得出我國(guó)的設(shè)施辣椒上的主要致病鐮刀菌有木賊鐮刀菌（F. equiseti）、多育

4、鐮刀菌（F. proliferatum）、藤倉(cāng)鐮刀菌（F. fujikuroi）、串珠鐮刀菌（F. verticillioides）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、茄腐鐮刀菌（F. solani），其中木賊鐮刀菌為優(yōu)勢(shì)菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中國(guó)設(shè)施辣椒上的優(yōu)勢(shì)菌株與國(guó)外的不同，因此在辣椒上伏馬毒素的防控和辣椒爛果病的預(yù)防要與國(guó)外的方法有所不同。
　　2、探索時(shí)間對(duì)不同致病鐮刀菌產(chǎn)伏馬毒素的影響及鐮刀菌在不同生物培養(yǎng)基中的產(chǎn)毒

5、規(guī)律。選取從我國(guó)設(shè)施辣椒上分離到的頻次較高的木賊鐮刀菌、多育鐮刀菌、藤倉(cāng)鐮刀菌、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、茄腐鐮刀菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將這些代表菌株分別接種到大米培養(yǎng)基中，25℃黑暗培養(yǎng)，分別選取培養(yǎng)7d、14d、21d、28d、35d檢測(cè)其伏馬毒素產(chǎn)量。檢測(cè)結(jié)果表明：串珠鐮刀菌、藤倉(cāng)鐮刀菌和多育鐮刀菌在0-28d時(shí)，伏馬毒素總產(chǎn)量逐漸升高，28d時(shí)達(dá)到最大，在28d-35d時(shí)，毒素總含量隨時(shí)間的增加而有所減少；尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌在21d時(shí)伏

6、馬毒素總量達(dá)到最高，在21d后隨著時(shí)間的增加毒素含量逐漸下降。將不同鐮刀菌分別接種到大米培養(yǎng)基和設(shè)施辣椒上，25℃黑暗培養(yǎng)14d，檢測(cè)不同培養(yǎng)基伏馬毒素含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：菌株在大米培養(yǎng)基上的產(chǎn)毒水平高于設(shè)施辣椒；相同鐮刀菌在不同的培養(yǎng)基上和不同時(shí)間產(chǎn)伏馬毒素水平存在顯著差異；不同菌株在相同的培養(yǎng)基上產(chǎn)毒水平也不相同。此外，研究還發(fā)現(xiàn)無(wú)論在大米培養(yǎng)基上還是設(shè)施辣椒上，茄腐鐮刀菌均能產(chǎn)生伏馬毒素，這一研究還未被報(bào)道。
　　3、對(duì)茄腐

7、鐮刀菌產(chǎn)伏馬毒素的分子機(jī)制進(jìn)行探究。一方面，采用特異性引物FUM1、FUM8、FUM19對(duì)茄腐鐮刀菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取高產(chǎn)伏馬毒素的串珠鐮刀菌作為正對(duì)照，及不產(chǎn)伏馬毒素的木賊鐮刀菌做負(fù)對(duì)照。另一方面，對(duì)該茄腐鐮刀菌進(jìn)行基因組高通量測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：由于茄腐鐮刀菌電泳無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，表明該鐮刀菌中并不含有 FUM1、FUM8、FUM19序列，通過(guò)對(duì)基因組高通量重測(cè)序結(jié)果分析，得出該菌株體內(nèi)無(wú)FUM基因存在，但通