利用熒光光譜技術研究蛋白質間的相互作用.pdf

1、生命體中細胞的信號傳導、基因表達、酶促代謝、涉及氧化還原的呼吸等很多生物化學反應過程都是在蛋白-蛋白相互作用的基礎上完成的。對蛋白-蛋白相互作用過程的深入研究對于理解和揭示細胞的功能調控機制及疾病控制與治療等方面都具有十分重要的科學意義和潛在的應用價值。
　　生物在進化的過程中，逐步形成了在感受外界脅迫下，利用自身調節(jié)體系來適應環(huán)境的變化。而在調節(jié)的信號傳遞中，激酶對底物的修飾或蛋白間氧化還原狀態(tài)的轉化等都是動態(tài)作用過程。這些作用

2、過程很難用Pull-down，免疫共沉淀和熒光共定位等傳統(tǒng)方法來驗證。本論文主要以光譜技術研究蛋白之間的相互作用，內容包括:
　　(1)以谷胱甘肽過氧化物酶(AtGPX3)和硫氧還蛋白(TRX)為研究體系。利用蛋白質定點突變、內稟熒光探針（色氨酸）和人工熒光探針—TF3、TF5(Cy3、Cy5的升級替代產(chǎn)品)的熒光光譜以及蛋白質十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)等方法和技術來研究蛋白相互作用中的電子轉移模式以及

3、蛋白質氧化態(tài)還原態(tài)之間的相互轉化。研究結果確定了谷胱甘肽過氧化物酶(GPX3)和硫氧還蛋白(TRX)的兩種不同狀態(tài)，對應不同的氧化還原特性;結合基因點突變技術，證實了GPX3和TRX相互作用時，二者之間電子傳遞模式是GPX3將電子傳遞給TRX，而并不是像通常情況下的TRX作為供氫體存在。
　　(2)以擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶(AtGPX3)和硫氧還蛋白(AtTRX9)為研究體系，利用蛋白熒光標記技術，單分子多通道全內反射熒光顯微(

4、TIRFM)系統(tǒng)、熒光共振能量轉移(FRET)等技術，在體相和單分子水平上研究了兩種蛋白間的相互作用。通過觀測蛋白內稟色氨酸的熒光光譜變化，以及熒光探針標記后AtGPX3和AtTRX9蛋白之間的FRET效應，獲得了蛋白之間存在相互作用的直接證據(jù)，并討論了相關的科學機制。實驗結果表明，擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶(AtGPX3)、硫氧還蛋白(AtTRX9)在不同環(huán)境下的不同狀態(tài)以及不同的氧化還原特性，證明了氧化態(tài)的AtGPX3與還原態(tài)的AtT