基于肽脫甲?；附Y(jié)構(gòu)的抗生素設(shè)計(jì)和合成研究.pdf

1、原核生物核糖體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)的合成中，在形成起始復(fù)合物之前甲硫氨酸-tRNA<'fMet>先進(jìn)行甲酰化酶催化的甲?；杉柞＜琢虬彼?tRNA<'fMet>：在肽鏈合成一定階段后，由肽脫甲?；?PDF，Peptide deformylase)催化脫甲酰化，然后由甲硫氨酸氨肽酶(MAP)脫去啟動(dòng)時(shí)接上的甲硫氨酸。肽脫甲?；?PDF，Peptide deformylase)是細(xì)菌生長(zhǎng)過程中蛋白質(zhì)合成所必需的一個(gè)酶，但在真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成

2、中并不需要，因此，PDF成為令人感興趣的新的抗菌藥物作用靶點(diǎn)。 PDF作為抑菌靶點(diǎn)的生化過程很明確，其晶體結(jié)構(gòu)和活性部位也已經(jīng)比較清楚，研究進(jìn)展較快，2002我們開始研究時(shí)共有28個(gè)晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道，至2006年初已有47個(gè)晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道。目前已報(bào)道與PDF抑制劑有關(guān)的抗生素共有異羥肟酸類、N-甲酰羥胺類、巰基肽類、苯并喹唑啉酮類及其它五類結(jié)構(gòu)，其中異羥肟酸類進(jìn)展最快，British Biotech和GeneSoft的BB-83698

3、，Vicuron的VRC-4887已進(jìn)入臨床研究，它們對(duì)金黃色葡萄球菌(包括耐甲氧西林者)、肺炎鏈球菌、腸球菌和一些耐藥鏈球菌同樣有效，因此，PDF抑制劑的研究已經(jīng)成為了前景樂觀的新的抗生素研究領(lǐng)域。 本研究從PDF晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)進(jìn)行藥物分子設(shè)計(jì)；通過對(duì)現(xiàn)有藥物分子特征分布的研究確定設(shè)計(jì)分子的“預(yù)篩指標(biāo)”，還對(duì)受體和對(duì)接方法的合理性進(jìn)行了考察。從理論上提出了藥物分子結(jié)構(gòu)的規(guī)律，設(shè)計(jì)了多類結(jié)構(gòu)的化合物，并合成了一類典型化合物。通過活

4、性測(cè)定，說明了理論設(shè)計(jì)的合理性與有效性。為了提高理論設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性，克服對(duì)接方法的不足，本研究還采用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法考察了設(shè)計(jì)化合物的結(jié)合能，通過于化合物測(cè)定活性的比較，證明了采用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法得到了得結(jié)果，有較高參考價(jià)值，本研究的主要內(nèi)容摘要如下： 1．PDF序列的分類及晶體結(jié)構(gòu)對(duì)所有PDF序列的代表性 對(duì)已經(jīng)報(bào)道的567個(gè)PDF的序列進(jìn)行了比對(duì)，根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)分成三大類，也即革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性和其它三類。對(duì)比對(duì)

5、的序列對(duì)應(yīng)位置上的殘基進(jìn)行了宏觀性質(zhì)指標(biāo)(包括：極性、柔性、構(gòu)象參數(shù)等)分析，結(jié)果表明各種來源的PDF結(jié)構(gòu)上有較大的相似性。 文獻(xiàn)報(bào)道了45個(gè)晶體和2個(gè)NMR測(cè)定結(jié)構(gòu)，我們?cè)谠O(shè)計(jì)藥物時(shí)通常都以已知結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進(jìn)行。所以，本研究又分析了已知立體結(jié)構(gòu)的PDF序列的相似性，結(jié)果表明其具有較高的相似度，立體結(jié)構(gòu)框架基本一致。在567個(gè)PDF所分成的三類結(jié)構(gòu)中分別選擇親源性較遠(yuǎn)的序列，在晶體結(jié)構(gòu)中都可以找到與它們相似度較高的序列，表明晶體結(jié)構(gòu)具

6、有廣泛的代表性。因此，基于現(xiàn)有的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)得到的抑制劑，非?？赡芫哂袕V譜抗菌作用，這也使得基于PDF的藥物設(shè)計(jì)更有意義。 2．常用藥物分子特征指標(biāo)和預(yù)篩指標(biāo) 通過對(duì)現(xiàn)有藥物的分子特征描述符(包括：極性、非極性、油水分配系數(shù)、氫鍵受體、氫鍵供體、分子大小、正電荷、負(fù)電荷等相關(guān)的指標(biāo))進(jìn)行了計(jì)算，得到分布概率，確定了各項(xiàng)指標(biāo)的分布范圍。對(duì)常用藥物的副作用進(jìn)行收集整理，根據(jù)人系統(tǒng)和組織主要將非特異性副反應(yīng)分為：血液系

7、統(tǒng)、心血管，胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、呼吸系統(tǒng)、肝臟、皮膚反應(yīng)等類別。分子特征符與副作用之間的統(tǒng)計(jì)規(guī)律大體可以概括為：極性大分子中，電荷偏多容易帶腎臟、胃腸道和血液副反應(yīng)；活性基團(tuán)偏多的藥物容易對(duì)肝臟產(chǎn)生毒性；結(jié)構(gòu)上極性偏小、脂溶性和芳香性較大的分子容易具有過敏反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)。對(duì)副反應(yīng)有關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，確定了最有代表性的指標(biāo)及其分布范圍，最有代表性的指標(biāo)包括：a_don、a_aec、Weight、logP(o/w)、Q_VSA

8、_FHYD、vsa_pol、Q_VSA_POL、CASA-、Q_VSA_PNEG、CASA+、Q_VSA_PPOS。通過這些指標(biāo)的預(yù)篩，在設(shè)計(jì)的早期就可以過濾掉許多風(fēng)險(xiǎn)很大的化合物，從而提高設(shè)計(jì)的實(shí)際效率。 3．對(duì)接受體模板的確定 選擇適當(dāng)?shù)氖荏w蛋白作為對(duì)接模板是分子設(shè)計(jì)最關(guān)鍵的問題之一。通過將PDF 47個(gè)已知結(jié)構(gòu)進(jìn)行疊合，以PDB(protein databank)代號(hào)為1bsk的結(jié)構(gòu)為參比，分析了不同結(jié)構(gòu)的活性

9、區(qū)域周圍氨基酸的分布，由此將對(duì)接模板分成了9類(其中2類是最新報(bào)道的)。以所有疊合后的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，分析了活性區(qū)域中對(duì)應(yīng)氨基酸殘基骨干a碳的坐標(biāo)差異，結(jié)果表明不同PDF在某些殘基上存在一定的差異，相同序列的酶晶體結(jié)構(gòu)與NMR結(jié)構(gòu)的差異較大。為了考察活性區(qū)域的變化情況，選擇了六個(gè)殘基的a碳形成的三角柱形作為活性區(qū)域的框架，計(jì)算了框架的邊長(zhǎng)(各對(duì)原子間的距離)，結(jié)果表明，不同晶體結(jié)構(gòu)的活性區(qū)域框架比較類似，晶體與NMR結(jié)構(gòu)的差異相對(duì)較大。根據(jù)

10、活性區(qū)域殘基分布和疊合情況，最后選擇了10個(gè)結(jié)構(gòu)(PDB代碼為：1bs8、1bsk、1g27、11m4、11m6、11qy、11ru、1r14、1rn5、1s17)作為下一步對(duì)接計(jì)算的模板。 4．對(duì)接方法的研究 比較了FlexX、DOCK5、MCDOCK等三種對(duì)接方法的結(jié)果。為了排除分子大小對(duì)VDW能量項(xiàng)的影響，將對(duì)接分?jǐn)?shù)進(jìn)行了處理，包括原子數(shù)、重原子數(shù)、分子VDW體積等校正，發(fā)現(xiàn)DOCK5和MCDOCK的對(duì)接分?jǐn)?shù)與

11、分子量之間存在較大的相關(guān)性。三種方法中FlexX方法受化合物分子量影響最小，而且分辨率最高，所有校正方法中FlexX對(duì)接評(píng)分除以vdw體積校正的方法受化合物分子量影響最小，且分辨率較高，因此在后面的計(jì)算中我們均采用FlexX對(duì)接方法。MCDOCK和DOCK5不管如何處理都很難抵消分子大小的影響，主要考慮減少分子量的影響時(shí)，可以進(jìn)行總原子的根號(hào)值校正，主要考慮分別率時(shí)，可用VDW的立方根值進(jìn)行校正。 5．分子的設(shè)計(jì) 根

12、據(jù)晶體結(jié)構(gòu)中配體與受體的結(jié)合方式，將分子分成三部分：離子結(jié)合區(qū)、骨架區(qū)和修飾區(qū)。設(shè)計(jì)工作分兩條線進(jìn)行，第一條線，首先分別設(shè)計(jì)離子結(jié)合區(qū)和骨架區(qū)不同結(jié)構(gòu)，逐步增加取代基，每步考慮的取代基主要涉及極性、幾何和芳香等不同的代表性結(jié)構(gòu)，最后得到核心結(jié)構(gòu)。第一條的線改造的目的主要是希望以環(huán)狀結(jié)構(gòu)取代帶兩個(gè)手性中心骨干區(qū)。第二條線，基于已知的配體MET-GLY-SER、actinonin和明系列的結(jié)構(gòu)，從修飾區(qū)開始改造，逐步往骨架區(qū)改動(dòng)，得到核心結(jié)

13、構(gòu)。共得到了5類代表性核心結(jié)構(gòu)及其最優(yōu)規(guī)律，為進(jìn)一步工作打下了基礎(chǔ)。 6.化合物的合成 在上述設(shè)計(jì)的代表性結(jié)構(gòu)中，選擇了化學(xué)上比較容易實(shí)施的一類化合物進(jìn)行了合成。以3-戊基丁二酸單甲醑作為起始物，在DCC作用下羧基與炔丙胺進(jìn)行偶聯(lián)形成N－炔丙基的中間體，接著與取代苯甲醛肟進(jìn)行1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)得到含異噁唑環(huán)的中間體，最后將酯基與羥胺進(jìn)行羥胺化形成所要的異羥肟酸類產(chǎn)物：2-戊基-N<'4>-羥基-N<'1>-[3-(取

14、代苯基)異噁唑基-5-]甲基丁二酰胺。合成的6個(gè)化合物經(jīng)初步測(cè)定對(duì)肺炎克雷伯和短小芽孢桿菌都有明顯的抗菌活性。表明基于PDF的理論設(shè)計(jì)取得了一定的成功。 7.化合物與PDF結(jié)合能的分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)接方法在理論上做了大量的簡(jiǎn)化，特別是把受體當(dāng)作剛性處理，方法本身的誤差使分?jǐn)?shù)差異一定范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)，而實(shí)際合成和測(cè)定化合物活性是非常困難的事。為了提高理論預(yù)測(cè)活性的準(zhǔn)確性，我們以分子動(dòng)力模擬評(píng)價(jià)了典型分子與lbsk的結(jié)合能，并