生物相容性C60衍生物的合成及其抑制神經(jīng)細胞凋亡作用研究.pdf

1、富勒烯獨特的分子結(jié)構(gòu),使其具有許多優(yōu)異的物理性質(zhì),在光、電、磁、藥物化學等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。富勒烯研究幾乎涉及物理學、化學以及材料科學的各個領(lǐng)域,同時對生物學、醫(yī)學等也產(chǎn)生了巨大沖擊,這使富勒烯家族成為當前科學界研究的熱點。本文采用分子設(shè)計原理,利用親核加成或氮卡賓等方法,合成了八種生物相容性的C60衍生物,除C60-β-丙氨酸衍生物外,其余C60衍生物均為首次合成,未見文獻報道。首次將以上合成的多種C60衍生物對神經(jīng)細胞進行離體

2、細胞實驗,用MTT、流式細胞術(shù)、熒光探針、熒光顯微鏡等方法測定及觀察神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,較深入地研究C60衍生物的微觀結(jié)構(gòu)、幾何尺寸、功能基團的種類與神經(jīng)細胞老化凋亡之間的關(guān)系及規(guī)律,初步探索其抑制神經(jīng)細胞凋亡的機理,為全新高效抑制神經(jīng)細胞凋亡的藥物的設(shè)計提供新的思路與方法,該研究在化學及生命、材料科學的交叉領(lǐng)域中有重大的理論意義及明確的應(yīng)用前景。其主要內(nèi)容包括:
　　1. C60與氨基酸類物質(zhì)在甲苯/乙醇混和溶劑中的親核加成

3、反應(yīng)得到水溶性C60氨基酸衍生物(1a,1b,1c,1d,1e),元素分析及LC-MS確定它們的加成度分別為:n=5(1a),7(1b),2(1c),6(1d)和8(1e)。在此反應(yīng)中,相轉(zhuǎn)移催化劑四丁基氫氧化胺TBAH能顯著提高反應(yīng)的速率及產(chǎn)率。以 C60胱氨酸衍生物的合成為例,通過加入 TBAH,C60的轉(zhuǎn)化率由14.64％提升至50.31%;反應(yīng)的速率也提高了近3倍。由于親水疏水相互作用及氫鍵力,C60氨基酸衍生物在水中自組裝形成

4、了10-800nm的球狀聚集體。
　　2.利用氮卡賓與C60的加成反應(yīng)制備了溶解于DMSO的C60氧化型谷胱甘肽衍生物(2a);利用N-羥甲基乙酰胺為巰基保護基團,利用親核加成反應(yīng)制備了水溶性的C60還原型谷胱甘肽衍生物(2b);利用C60與葉酸在甲苯/乙醇/水混和溶劑中的親核加成反應(yīng)制備了水溶性的C60葉酸衍生物(2c)。元素分析及LC-MS確定它們的加成度分別為:n=1-2(2a),2(2b),1(2c)。由于親水疏水相互作用

5、,C60基神經(jīng)細胞保護劑在其溶液中形成了100-500nm的球狀聚集體。
　　3.采用鄰苯三酚自氧化化學發(fā)光體系產(chǎn)生了O2,并檢測了生物相容性C60衍生物清除O2的活性。生物相容性C60衍生物能明顯清除化學發(fā)光體系中產(chǎn)生的O2活性氧自由基。清除活性2a>2b>1a>1d>1b>2c>1c>1e。采用鄰菲羅啉化學發(fā)光體系產(chǎn)生了OH,并檢測了生物相容性C60衍生物清除-OH的活性。清除活性2a>2b>1a>1d>1b>1c>1e>2c

6、。研究顯示:C60衍生物清除自由基的活性與母體C60上剩余π鍵數(shù)目、加成基團位阻效應(yīng)、加成基團電子效應(yīng)、加成基團與ROS反應(yīng)活性及生物相容性C60衍生物溶液中的聚集狀態(tài)息息相關(guān)。
　　4.利用RF光譜檢測了1a,1b,1e三種C60氨基酸衍生物在細胞內(nèi)外含量;利用DCF-DA為熒光探針,流式細胞計為測試手段檢測了1a,1b,1e對于細胞內(nèi)活性氧自由基的清除效率;利用MTT、PI染色流式細胞技術(shù)、Hoechst33342/PI染色熒

7、光照相等方法,檢測了1a,1b,1e對于H2O2誘導的PC12細胞凋亡的抑制作用。結(jié)果顯示,1a,1b,1e生物相容性良好,且能有效的保護由活性氧聚集引起的PC12細胞的損傷,保護活性1b>1a>1e。在本研究中,較深入的研究了C60衍生物的聚集狀態(tài)對其抑制神經(jīng)細胞凋亡活性的影響。C60氨基酸衍生物的神經(jīng)細胞保護活性與其清除活性氧自由基效率及聚集狀態(tài)息息相關(guān)。
　　利用Tietze還原酶法檢測了C60氧化型谷胱甘肽衍生物2a對細胞

8、GSH水平的影響;檢測2a對神經(jīng)細胞凋亡抑制作用實驗類同于C60氨基酸衍生物的檢測方法。結(jié)果顯示,2a在抗氧化及神經(jīng)保護活性方面高于相應(yīng)的母體GSSG,其提高的幅度較為明顯,約為30%。
　　利用細胞計數(shù)、細胞形態(tài)學觀察、MTT法等檢測 C60還原型谷胱甘肽衍生物2b對于N2a細胞增殖與活力的影響;利用分光光度法檢測2b對于N2a細胞中Caspase3酶活性的影響;利用Annexin V-FITC/PI染色流式細胞技術(shù),檢測了2b

9、對于H2O2誘導的N2a細胞凋亡的抑制作用。結(jié)果顯示,2b有利于N2a的增殖與活力,能顯著降低H2O2引起的Caspase3酶活性增高,并且能抑制由H2O2引起的細胞凋亡。2b具有抑制細胞凋亡作用,且強于谷胱甘肽及C60氨基酸水溶性衍生物。
　　檢測C60葉酸衍生物2c對神經(jīng)細胞凋亡抑制作用實驗類同于C60氨基酸衍生物的檢測方法。結(jié)果顯示,2c清除ROS的性能并不十分出色,但其對H2O2誘導PC12細胞凋亡的抑制作用依然出色,這可