粘細(xì)菌分子伴侶-引領(lǐng)蛋白樣通路的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、RegulatoryMechanismsunderlyingtheExpressionoftheChaperone／Usher1ikePathwayin蜘DcDcc掰sx口刀砌比sADissertationSubmittedtoSoutheastUniVersi夠FortheAcademicDegreeofMasterofBiochemist巧andMolecularBiologyBYXUShihuiSupervisedbyProfes

2、sorMAOXiaohuaInstituteofLifeScienceSoutheastUniVersi妙June2015中文摘要粘細(xì)菌分子伴侶／引領(lǐng)蛋白樣通路的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制研究生徐世慧指導(dǎo)老師毛曉華教授東南大學(xué)生命科學(xué)研究院發(fā)育與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中文摘要目的。分子伴侶／引領(lǐng)蛋白(chaperone／usher，CU)通路是目前為止最普遍最具有代表性的菌毛裝配途徑，分子伴侶與引領(lǐng)蛋白相互協(xié)作組成一種特殊的分泌系統(tǒng)，可以將蛋白

3、分泌至細(xì)胞表面。CU通路包括經(jīng)典型、交替型和遠(yuǎn)古型三大家族，其中遠(yuǎn)古型CU通路分布最廣。黃色粘球菌中的，，zc刎BC『D也即MXAN38853882基因簇編碼遠(yuǎn)古型CU通路，其中肌c州BC組成操縱子，實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)對搬c以BC的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制進(jìn)行了研究，并已篩選鑒定出一個，，2c鰣BC的上游調(diào)控基因—堋AN2872。本論文擬篩選粘細(xì)菌CU樣通路的其他調(diào)控基因，并進(jìn)一步明確MXAN2872的功能特性，這有助于我們發(fā)現(xiàn)粘細(xì)菌CU樣通路調(diào)

4、節(jié)網(wǎng)絡(luò)的新組分，為揭示遠(yuǎn)古型CU通路的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為阻斷細(xì)胞表面粘附性致病因子的合成提供新思路。方法：1通過電穿孔方法將轉(zhuǎn)座子m撕ner(KmR)隨機(jī)插入至DKl622／pMPMXAN3883轉(zhuǎn)錄融合菌株中，在含有Xgal的營養(yǎng)缺陷型平板TPM上依據(jù)藍(lán)白斑篩選肌c糾BC上游調(diào)控基因，隨后定位轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)。2通過報告基因和免疫印跡方法明確候選調(diào)控基因在野生型菌株中的表達(dá)圖譜及候選調(diào)控基因的缺失對mc州BC表達(dá)的影響。3通過基因敲

5、除及定點(diǎn)突變確定候選調(diào)控基因?qū)α腸州BC表達(dá)以及多細(xì)胞發(fā)育的影響。4通過硫酸鹽的缺乏探究候選調(diào)控基因與硫代謝之間的潛在關(guān)系。5通過定點(diǎn)突變以及紫外可見吸收光譜分析，進(jìn)一步分析MXAN2872的生化特性。結(jié)果：1通過轉(zhuǎn)座予隨機(jī)插入突變篩選出一株聊c剃BC表達(dá)異常的突變株，免疫印跡結(jié)果表明該轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變株中McuA蛋白表達(dá)與野生型細(xì)胞相比延后，測序明確插入位點(diǎn)為MXAN3487。2報告基因活性檢測表明MXAN3487在野生型DKl62

6、2中從發(fā)育12h后開始表達(dá)，48h表達(dá)量最高，隨后表達(dá)水平開始下降；聊c訓(xùn)曰C在△MXAN3487中的表達(dá)與野生型相比，不僅表達(dá)時間延后而且表達(dá)量明顯下降，直到發(fā)育至24小時以后才開始有少量的表達(dá)。3通過對△MXAN3487敲除菌株表型的觀察，發(fā)現(xiàn)其多細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程滯后且子實(shí)體形態(tài)異常，Westemblot結(jié)果顯示該敲除菌直到發(fā)育至72小時才有McuA蛋白表達(dá)。4生物信息學(xué)預(yù)測MXAN3487氨基酸序列中含有保守的P環(huán)(phosphate