JAK1對(duì)平面細(xì)胞極性通路的調(diào)控及機(jī)制的研究.pdf

1、胚胎發(fā)育過程中，重要生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)異常將導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生。平面細(xì)胞極性（Planar cell polarity, PCP）的建立是胚胎發(fā)育過程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。具體表現(xiàn)為細(xì)胞定向遷移，哺乳動(dòng)物末端肢節(jié)的定向伸長(zhǎng)，體毛沿前后軸排列以及靜纖毛束定向排列于內(nèi)耳等。幾乎所有的組人體織和器官都需要PCP通路來控制細(xì)胞的極性行為。目前已發(fā)現(xiàn)PCP調(diào)控因子的突變將導(dǎo)致諸多疾病發(fā)生，例如神經(jīng)管畸形，短肢侏儒癥以及癲癇[1-3]。
　　神經(jīng)管

2、畸形(neural tube defect，NTD)是胚胎發(fā)育早期因神經(jīng)管不閉合或閉合不全導(dǎo)致的嚴(yán)重出生缺陷。根據(jù)神經(jīng)管未閉合的位置和其嚴(yán)重程度，NTD會(huì)導(dǎo)致無腦兒、腦膨出、脊柱裂，以及顱脊柱裂等。近年來通過對(duì)NTD動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，PCP信號(hào)通路的核心基因Vangl2在神經(jīng)管閉合過程中起至關(guān)重要的作用，成為NTD遺傳學(xué)研究的一個(gè)新熱點(diǎn)[4]。
　　PCP信號(hào)通路屬于Wnt信號(hào)通路的非經(jīng)典通路，最早在果蠅的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，影響和

3、調(diào)控果蠅體部纖毛及復(fù)眼等高度有序化結(jié)構(gòu)的排列和形成。PCP通路在進(jìn)化上非常保守，從昆蟲到哺乳動(dòng)物都具有一組共同的核心調(diào)控基因。PCP通路核心基因包括:VanGogh，Ror2，Dishevelled(Dsh/Dvl)，F(xiàn)rizzled(FZ)，Prickle(Pk)，F(xiàn)lamingo(Fmi)和Diego(Dgo)等[5，6]。遺傳和生化分析表明PCP核心蛋白質(zhì)形成了復(fù)雜的復(fù)合體，其核心蛋白質(zhì)的數(shù)量和亞細(xì)胞非對(duì)稱分布對(duì)于PCP通路的信號(hào)

4、傳遞至關(guān)重要[7]。核心組分的突變和表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致PCP通路失活，引起相關(guān)疾病。近期研究表明，Vangl2在細(xì)胞內(nèi)呈非對(duì)稱分布，在Wnt5a的作用下，Vangl2發(fā)生絲、蘇氨酸位的磷酸化進(jìn)而與Vangl2與Ror2形成復(fù)合體。Vangl2磷酸化水平與其活性正相關(guān)。Wnt5a通過磷酸化Vangl2調(diào)節(jié)其活性，從而梯度影響細(xì)胞平面極性的建立。
　　盡管目前大量的遺傳學(xué)研究已證明Vangl2的胞內(nèi)不對(duì)稱分布及其磷酸化水平在脊椎動(dòng)物末端肢

5、節(jié)發(fā)育等眾多形態(tài)發(fā)生過程中的起著重要作用，Vangl2作用的生化和細(xì)胞學(xué)機(jī)理目前仍尚未被揭示。研究Vangl2如何接受上游信號(hào)調(diào)節(jié)激活以及如何調(diào)節(jié)下游信號(hào)分子事件對(duì)于揭示W(wǎng)nt/PCP信號(hào)通路的作用機(jī)理至關(guān)重要。因此，本課題從鑒定Vangl2信號(hào)復(fù)合體新成分入手，通過直接的免疫共沉淀法對(duì)Vangl2復(fù)合體進(jìn)行了分離，用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定獲得系列可能參與復(fù)合體功能和調(diào)節(jié)的相互作用蛋白，JAK1即其中之一。JAK即Janus Kinase（兩面神

6、激酶），是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶(PTK)。JAK1目前研究比較明確的是其在JAK-STAT信號(hào)通路中的功能。該信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程。最近的研究發(fā)現(xiàn)JAK-STAT通路在細(xì)胞遷移，原腸胚的會(huì)聚延伸等極性行為中也發(fā)揮作用[8-10]，提示JAK1在PCP通路中可能發(fā)揮重要作用。我們首先利用免疫共沉淀(IP)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)確定JAK1與Vangl2有直接的相互作用且兩者在細(xì)胞膜上有共定位，

7、提示JAK1作為一個(gè)新組分可能通過影響Vangl2參與PCP通路的激活。同時(shí)，JAK1能夠特異性影響Vangl2的酪氨酸磷酸化，并與Vangl2的絲蘇氨酸磷酸化水平呈負(fù)相關(guān)，且JAK1與Vangl2的結(jié)合程度也與Vangl2的絲蘇氨酸磷酸化水平成負(fù)相關(guān);另一方面，JAK1又促進(jìn)Vangl2與Ror2的結(jié)合，這些結(jié)果說明JAK1可能同時(shí)影響其他PCP通路的核心組分如Ror2，Wnt5a來進(jìn)一步調(diào)控Vangl2。
　　后續(xù)研究中，我們

8、在輔助因子Ror2上找到了突破口。IP結(jié)果顯示JAK1與Ror2有直接的相互作用，JAK1使Ror2發(fā)生絡(luò)氨酸磷酸化，并且其絡(luò)氨酸磷酸化水平受Wnt5a時(shí)相(time course)的調(diào)控，Wnt5a時(shí)相同時(shí)影響了Ror2與JAK1及Vangl2結(jié)合:隨著Wnt5a刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，JAK1與Ror2，Vangl2的結(jié)合減弱，Ror2的絡(luò)氨酸磷酸化水平降低，同時(shí)Ror2與Vangl2的結(jié)合增強(qiáng)。當(dāng)加入JAK1激酶抑制劑后，這些變化消失。<