陰溝腸桿菌海藻糖酶酶學(xué)性質(zhì)鑒定及體外分子改良.pdf

1、海藻糖普遍存在于自然界，是一種非還原性二糖。海藻糖酶可以將海藻糖特異性地水解為葡萄糖，海藻糖酶作為食品添加劑可以治療二糖缺乏癥，人體內(nèi)某些腎臟疾病的診斷可以通過檢測尿海藻糖酶的活性來實現(xiàn)，故而海藻糖酶在食品、醫(yī)療等領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價值，此外，也可以通過研究海藻糖酶的結(jié)構(gòu)與功能開發(fā)新型酶抑制劑應(yīng)用于昆蟲防治中。
　　本研究從陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae strain AR_0002)中克隆到了一個海藻糖酶基

2、因，將其命名為treE。treE基因全長1650bp，GC含量58％，編碼549個氨基酸，分子量為63.5kDa，預(yù)測的pI為4.93。與NCBI數(shù)據(jù)庫中的海藻糖酶基因序列對比后發(fā)現(xiàn)，treE與來自于Enterobacter Cloacae ATCC13047的海藻糖酶基因序列具有88％的一致性。
　　酶學(xué)性質(zhì)分析表明，treE的最適反應(yīng)溫度和pH分別為50℃和6.0。在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)，酶在4℃條件下處理了48h，保持

3、了80％以上的活性，說明在偏中性的條件下，該酶的穩(wěn)定性良好。Mn2+，F(xiàn)e3+(1mM，5mM)，Co2+(1mM)可以提高treE的活性， Cu2+，F(xiàn)e3+(10mM)，Mg2+(10mM)，Co2+(10mM)抑制了treE的活性。最適條件下，treE的Km是3.318 mmol/L，Vmax是0.445 mmol/L·min， kcat是1265.164s-1，催化效率(kcat/Km)為381.303 L·mmol-1·s-1

4、。
　　為了提高treE的催化活性，對treE進行了體外誘變，構(gòu)建了隨機突變文庫，利用實驗室建立的高通量篩選方法，我們從16000個隨機突變體中篩選獲得了一個酶活提高突變子1-D8。序列分析表明，1-D8含有兩個突變位點:Tyr22Cys和Trp491Arg。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，1-D8的最適反應(yīng)溫度為45℃，比野生型降低了5℃;最適反應(yīng)pH為6.5，用pH5.5-9.0的緩沖液在4℃下處理48h后，仍保留80％以上的活性。動力學(xué)分

5、析表明，1-D8的Km是3.082 mmol/L，kcat值為1819.651 s-1，kcat/Km值為590.412 L·mmol-1·s-1，比野生型提高了54.8％。
　　為了探究1-D8中兩個突變位點對酶活的影響，本研究依次對它們進行了單點回復(fù)突變。酶動力學(xué)分析表明， Y22C的Km是3.355mmol/L， kcat為1331.910 s-1，催化效率(kcat/Km)為396.993 L·mmol-1·s-1，比野生

6、型提高了4.0％。突變體W491R的Km值為3.060mmol/L，kcat值為1734.137s-1，催化效率(kcat/Km)為566.711 L·mmol-1·s-1，比野生型高了48.6％。這表明1-D8活性的提高主要來自突變位點W491R的貢獻。
　　此外，本研究通過結(jié)構(gòu)模擬與分子對接，初步確定R168可能與treE的催化效率有關(guān)。為了驗證這一推測，我們構(gòu)建了單點突變R168G，其Km為2.380mmol/L，kcat為