B族G蛋白偶聯(lián)受體PAC1四環(huán)素誘導(dǎo)可控表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、目的:PAC1是神經(jīng)肽垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的特異性受體,屬于B族G蛋白偶聯(lián)受體,介導(dǎo)PACAP的神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、神經(jīng)保護(hù)及調(diào)控神經(jīng)再生等生物學(xué)功能,其生理性及病理學(xué)高表達(dá)與其所介導(dǎo)的保護(hù)細(xì)胞、抗細(xì)胞氧化損傷及抗細(xì)胞凋亡作用密切相關(guān)。Tet-on表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)是目前最理想應(yīng)用最廣泛的真核生物基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng),能夠高效、

2、嚴(yán)格地調(diào)控目的基因的表達(dá)。為了深入了解 PAC1的功能,構(gòu)建PAC1可調(diào)控表達(dá)的細(xì)胞系,本課題通過(guò)優(yōu)化的Tet-on真核表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)PAC1在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞的強(qiáng)力霉素(doxycycline,Dox)依賴(lài)的可控表達(dá),初步探討PAC1的表達(dá)水平與其所介導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性和抗凋亡活性之間的關(guān)系。
　　方法:通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pEYFP-PAC1-EYFP進(jìn)行雙酶切得到編碼P

3、AC1和增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP,enhancedyellow fluorescent protein)的融和基因PAC1-EYFP,將融和基因PAC1-EYFP克隆到四環(huán)素反應(yīng)元件pTRE-Tight載體上,獲得重組表達(dá)載體pTRE-PAC1-EYFP;基因測(cè)序鑒定正確后將改進(jìn)后新型的四環(huán)素調(diào)節(jié)元件載體pTet-on advanced和反應(yīng)元件載體pTRE-PAC1-EYFP依次轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞中;遺傳霉素G418和潮霉素(Hygr

4、omycin)依次篩選含有兩個(gè)元件的陽(yáng)性克隆PAC1-Tet-CHO,使用梯度濃度四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素Dox誘導(dǎo)PAC1-EYFP表達(dá),48 h后熒光觀(guān)察及Westernblot檢測(cè)PAC1表達(dá)水平,并通過(guò)檢測(cè)不同表達(dá)水平PAC1-EYFP的細(xì)胞增殖活性和抗缺血清誘導(dǎo)凋亡活性及相關(guān)指標(biāo),包括胞內(nèi)第二信使cAMP基礎(chǔ)水平,抗凋亡蛋白Bcl-2(B cell lymphoma/leukemia-2)的表達(dá)水平與凋亡蛋白Caspase-3的活

5、性等,嘗試揭示PAC1不同表達(dá)水平與其所介導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性和抗凋亡活性之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:本研究利用Tet-on表達(dá)調(diào)控系統(tǒng),成功地構(gòu)建了重組表達(dá)載體pTRE-PAC1-EYFP,并成功篩選出抗G418和抗潮霉素的細(xì)胞系PAC1-Tet-CHO。熒光檢測(cè)和Westernblot結(jié)果顯示,PAC1-Tet-CHO細(xì)胞系可實(shí)現(xiàn)Dox依賴(lài)的PAC1-EYFP可控表達(dá)、并且具有良好誘導(dǎo)性及傳代穩(wěn)定性。PAC1-Tet-CHO細(xì)胞系在傳

6、10代后仍能穩(wěn)定地可控表達(dá)PAC1-EYFP。流式細(xì)胞術(shù),ELISA以及MTT法檢測(cè)不同表達(dá)水平PAC1-EYFP細(xì)胞的增殖活性和抗缺血清誘導(dǎo)凋亡活性及相關(guān)指標(biāo)的結(jié)果均顯示:在正常培養(yǎng)條件下,PAC1-EYFP表達(dá)水平越高,細(xì)胞增殖活性越強(qiáng),具有較高的胞內(nèi)cAMP水平;而在缺血清培養(yǎng)條件下,即沒(méi)有PAC1配體激活的情況下,PAC1-EYFP表達(dá)水平高的細(xì)胞具有較高的抗凋亡活性、較高的細(xì)胞殘留活性以及較高的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平和

7、較低的凋亡蛋白Caspase-3的活性;顯示了PAC1可賦予CHO細(xì)胞其表達(dá)水平依賴(lài)的增殖活性和抗缺血清誘導(dǎo)凋亡活性,并且PAC1可能具有非配體依賴(lài)激活的抗凋亡固有活性。
　　結(jié)論:本研究通過(guò)Tet-on表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)成功構(gòu)建了Dox依賴(lài)的PAC1可控表達(dá)系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)PAC1具有賦予細(xì)胞其表達(dá)水平依賴(lài)的細(xì)胞增殖活性和抗缺血清誘導(dǎo)凋亡的活性,并顯示PAC1具有非配體依賴(lài)激活的固有活性。研究結(jié)果不僅助于闡明過(guò)表達(dá)PAC1的生理學(xué)與病理學(xué)的