一種節(jié)桿菌來源的透明質(zhì)酸酶的研究.pdf

1、透明質(zhì)酸是一種高分子酸性黏多糖，廣泛存在于脊椎動物組織細胞外基質(zhì)中。透明質(zhì)酸在炎癥、創(chuàng)傷愈合、血管再生等方面發(fā)揮重要的作用。透明質(zhì)酸分子量范圍十分廣泛。透明質(zhì)酸的生理功能與其分子量大小和在何種情況下合成密切相關(guān)。目前商品大分子量透明質(zhì)酸主要通過微生物發(fā)酵法獲得，極少數(shù)來源于動物組織提取。低分子量透明質(zhì)酸通過物理或者化學的方法降解透明質(zhì)酸獲得。這些方法反應條件劇烈，往往會破壞單糖的殘基結(jié)構(gòu)，同時隨機降解糖苷鍵，因此無法獲得均一的透明質(zhì)酸。

2、使用酶解法制備小分子透明質(zhì)酸，條件溫和，特異性降解糖苷鍵，可以獲得高質(zhì)量透明質(zhì)酸，因此備受人們關(guān)注。
　　透明質(zhì)酸酶是主要降解透明質(zhì)酸的一類糖苷酶。最初作為“擴散因子”被發(fā)現(xiàn)，之后作為藥物滲透劑促進藥物吸收、手術(shù)后水腫消散和局部麻醉效果等。除了動物睪丸和毒液中，越來越多的微生物已被報道可以產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶。但動物來源的透明質(zhì)酸酶原料有限，微生物制備透明質(zhì)酸酶越來越受到關(guān)注。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多微生物都可以產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶，但酶的活性都普遍

3、偏低，主要原因是產(chǎn)酶量低。本研究對菌株基因組進行了測序，通過基因組分析獲得編碼透明質(zhì)酸酶的氨基酸序列，并使用SDS-PAGE、Native-PAGE和質(zhì)譜對此序列進行了驗證。并對透明質(zhì)酸酶家族的活性架構(gòu)進行了生物信息學分析。設(shè)計了重組載體，完成了此透明質(zhì)酸酶的外源表達和重組透明質(zhì)酸酶的分離純化及酶學性質(zhì)研究。最后使用熒光輔助糖電泳法對酶解產(chǎn)物進行了研究。
　　1.菌株基因組測序和序列分析
　　基因組測序的結(jié)果顯示菌株基因組大

4、小為4174362 bp，含有基因4568條。經(jīng)過分析注釋獲得一條可能為編碼透明質(zhì)酸酶的基因。此基因編碼的蛋白分子量約83 kDa，等電點為6.55。
　　2.電泳和質(zhì)譜對獲得的編碼序列進行驗證
　　首先對培養(yǎng)48 h的野生型菌株的發(fā)酵上清液進行超濾離心，然后進行電泳檢測。SDS-PAGE結(jié)果顯示在83 kDa附近有蛋白條帶。活性電泳檢測結(jié)果表明，發(fā)酵上清液具有透明質(zhì)酸酶酶活，同時只有一條活性條帶，說明此菌株表達且只表達一種

5、透明質(zhì)酸酶。胞外蛋白質(zhì)譜結(jié)果分析表明有29條肽段與注釋出來的編碼序列高度匹配，說明細菌表達了注釋基因編碼的蛋白?；蚪M分析獲得的基因為編碼透明質(zhì)酸酶的基因。
　　3.透明質(zhì)酸酶活性架構(gòu)的生物信息學分析
　　在CAZy數(shù)據(jù)庫中，透明質(zhì)酸酶主要屬于GH56和PL8家族。分析活性架構(gòu)區(qū)域的序列與結(jié)構(gòu)特征對于研究透明質(zhì)酸酶的作用機理具有重要意義。本文對這兩個家族的透明質(zhì)酸酶活性架構(gòu)的氨基酸進行了分析，并制作了活性中心序列譜。

6、　　4.透明質(zhì)酸酶的外源表達和純化
　　選取pET-28a作為載體，大腸桿菌(BL21)為工程菌。在20℃，200rpm，1 mM IPTG的條件下，構(gòu)建的表達菌株(BL21)成功表達出可溶性透明質(zhì)酸酶。使用不同濃度的咪唑洗脫液對鎳柱進行洗脫，在100 mM咪唑洗脫液洗脫時可以獲得電泳純透明質(zhì)酸酶，此酶可以用于后期研究。
　　5.重組透明質(zhì)酸酶的酶學性質(zhì)研究
　　(1)溫度和pH對重組HAase的影響
　　重組透

7、明質(zhì)酸酶最適反應溫度為42℃，在37℃和42℃之間酶活均很高，且穩(wěn)定性較好。50℃保溫10 min，酶活僅剩約10％。重組透明質(zhì)酸酶最適pH為6.5，pH5.5-8.0時，酶的穩(wěn)定性較高，室溫放置2h酶活依然可以保留在80％以上。當pH大于9.0或小于4.0時，重組透明質(zhì)酸酶完全失活。
　　(2)不同濃度的NaCl和NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液對酶活的影響
　　當NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液濃度為5 mmol

8、/L時酶活最高，但是對于酶活的提升并不明顯，僅提高約16％。但稍高一點的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液對酶活產(chǎn)生了抑制效果，當NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液的濃度達到200 mmol/L時酶活降低到80％以下。NaCl濃度為5 mmol時酶活顯示最高，隨著濃度的增加酶活有一定下降但總的來說添加適當?shù)腘aCl對酶活有提升作用(最高濃度只做到了200 mmol/L)。
　　(3)金屬離子、EDTA及表面活性劑對酶活的影響<

9、br>　　Ca2+、Mg2+、Ba2+對酶活具有促進作用;酶液中含有100 mmol/LBaCl2時，酶活最高(約為168％)。10 mmol/L的Cu2+和Zn2+可以明顯的抑制酶的活性，其中Cu2+可以使酶完全失活，Zn2+則使酶活減少近80％。10 mmol/L的EDTA對酶活基本不產(chǎn)生影響，但是當濃度增加到100 mmol/L，重組透明質(zhì)酸酶的活性明顯降低，大約減少80％。
　　非離子型表面活性劑Triton X-100的

10、加入對酶活產(chǎn)生了一定的抑制作用，但酶活的降低并不明顯，2％ Triton X-100室溫處理酶液30 min酶活仍能保留80％以上。但是離子型表面活性劑SDS在0.5％濃度下就可以使重組透明質(zhì)酸酶完全失活。
　　(4)重組透明質(zhì)酸酶的底物特異性研究
　　重組透明質(zhì)酸酶特異性降解透明質(zhì)酸，不能降解硫酸軟骨素、肝素和羧甲基纖維素鈉。
　　(5)重組透明質(zhì)酸酶降解透明質(zhì)酸的酶動力學研究
　　重組透明質(zhì)酸酶的Km和Vma