銅（Ⅱ）鎘（Ⅱ）、幾種小分子同血清白蛋白的相互作用研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的功能分子，在所有的生命過程中起著關(guān)鍵的作用，具有運(yùn)載和儲存功能，其特定結(jié)構(gòu)與其生物功能密切相關(guān)。血清白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，它由一條單獨(dú)的氨基酸多肽鏈構(gòu)成，其三級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)，其中包含3個結(jié)構(gòu)域，即domain Ⅰ、domain Ⅱ和domain Ⅲ。每個結(jié)構(gòu)域包含A、B兩個亞區(qū)，以槽口相對的方式形成一種圓筒狀結(jié)構(gòu)。其中位于domain Ⅱ和domainⅢ的Site Ⅰ和Site Ⅲ兩個結(jié)合位點與許多小分

2、子化合物具有較強(qiáng)結(jié)合能力，能夠與許多內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)結(jié)合，起到存儲和轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。血清白蛋白具有許多重要的生理功能，可與許多化學(xué)物質(zhì)(如金屬離子、脂肪酸、氨基酸、激素、藥物及污染毒物等)以不同方式結(jié)合，并攜帶著這些物質(zhì)通過血液在體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)、運(yùn)輸、分配和代謝。通過研究化學(xué)物質(zhì)與血清白蛋白相互作用，可獲取化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)被轉(zhuǎn)運(yùn)、分配和代謝過程的重要信息。在金屬離子、藥物藥理和毒理研究、污染毒物的危害機(jī)理及基因變異研究等方面具有重要意義。

3、該領(lǐng)域已經(jīng)成為從事生命科學(xué)、化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)科研工作者共同關(guān)注的課題之一。本論文基于開展小分子與蛋白質(zhì)相互作用的重要意義及國內(nèi)外研究趨勢，在前人工作的基礎(chǔ)上，綜合利用熒光光譜、紫外一可見吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜((FTIR)、同步熒光光譜和三維熒光光譜，從以下幾方面進(jìn)行了研究： 在第一章的緒論中介紹了五個方面的內(nèi)容：1．概述；2．小分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究方法；3．小分子與蛋白質(zhì)相互作用獲取的信息；4．小分子與蛋白質(zhì)相互作用

4、的研究現(xiàn)狀；5．立題依據(jù)和研究內(nèi)容。重點介紹了小分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究方法和手段及能夠獲取的信息。闡述了本論文的目的和意義，并對該方面未來的發(fā)展進(jìn)行了預(yù)測和展望。 在第二章中在模擬生理條件下利用紫外光譜法和熒光光譜法研究了Cu(Ⅱ)與牛血清白蛋白的相互作用。利用熒光光譜法研究了不同溫度下Cu(Ⅱ)對牛血清白蛋白的猝滅情況，采用Stem-Volmer方程和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并利用熱力學(xué)公式

5、推導(dǎo)了兩者之間的相互作用力。研究中發(fā)現(xiàn)，Cu(Ⅱ)對牛血清白蛋白BSA的內(nèi)源熒光猝滅以靜態(tài)猝滅為主，二者之間生成了不發(fā)熒光的復(fù)合物是導(dǎo)致熒光猝滅的主要原因。Cu(Ⅱ)——牛血清蛋白相互作用過程是一個熵增加、吉布斯自由能降低的自發(fā)超分子作用過程，二者之間的作用力以疏水作用力為主。Cu(Ⅱ)會導(dǎo)致血清蛋白色氨酸殘基和酪氨酸殘基附近微環(huán)境極性增加，疏水性略有降低，使得牛血清白蛋白的肽鏈伸展，α-螺旋含量減少。紫外光譜法進(jìn)一步驗證了Cu(Ⅱ)與

6、牛血清白蛋白之間的相互作用。通過改變激發(fā)波長，采用熒光光譜法研究了Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)對人血清白蛋白和牛血清白蛋白上的2種熒光基團(tuán)的猝滅情況及結(jié)合位點，紫外光譜法研究了二者共存時與血清白蛋白共有的結(jié)合位點的競爭。研究中發(fā)現(xiàn)，Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)對血清白蛋白的色氨酸殘基和酪氨酸殘基均具有猝滅作用，Cu(Ⅱ)的猝滅程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于Cd(Ⅱ)。Cu(Ⅱ)只與血清蛋白中214位色氨酸殘基發(fā)生作用，而Cd(Ⅱ)除了與血清白蛋白的214位發(fā)生作用外

7、，還和牛血清蛋白獨(dú)有的135位色氨酸殘基發(fā)生作用。Cu(Ⅱ)與Cd(Ⅱ)同時存在時Cu(Ⅱ)與牛血清白蛋白的結(jié)合占主導(dǎo)作用。在第三章中在模擬生理條件下利用紫外光譜法和熒光光譜法研究了雜多酸鹽K<,7>[PTi<,2>W<,10>O<,40>]·6H<,2>O(PM-19)與牛血清白蛋白和人血清白蛋白的相互作用。利用熒光光譜法研究了不同溫度下PM-19對兩種血清蛋白的猝滅情況，采用Stem-Volmer方程和Lineweaver-Burk

8、雙倒數(shù)方程和雙對數(shù)方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲取了結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)。并利用熱力學(xué)公式研究了PM-19與蛋白作用的熱力學(xué)參數(shù)及主要作用力類型。采用F6rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計算了PM-19與牛血清白蛋白和人血清白蛋白結(jié)合時結(jié)合位置與蛋白質(zhì)分子中熒光發(fā)射基團(tuán)之間的距離。采用同步熒光光譜法探討了PM-19對血清蛋白構(gòu)象的影響。研究中發(fā)現(xiàn)PM-19對血清蛋白的內(nèi)源熒光具有強(qiáng)烈的猝滅作用，靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致血清蛋白的內(nèi)源熒光猝滅的

9、主要原因。PM-19和血清蛋白形成的復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)在10<'4>-10<'6>L·mol<'-1>，表明兩者的結(jié)合較穩(wěn)定，說明PM-19可被血清蛋白存儲和運(yùn)輸。與牛血清白蛋白和人血清白蛋白的結(jié)合位點數(shù)分別為0.89和0.85。PM-19與牛血清白蛋白之間的主要作用力為靜電作用力；PM-19與人血清白蛋白之間的主要作用力為氫鍵和范德華力。PM-19與牛血清蛋白的結(jié)合距離為為4.14nm；PM-19與人血清白蛋白中色氨酸殘基結(jié)合位置距離為

10、4.21nm。PM-19與血清蛋白的作用點位靠近色氨酸殘基，二者結(jié)合并不影響血清蛋白中熒光基團(tuán)色氨酸殘基和酪氨酸殘基附近的微環(huán)境，并不改變血清蛋白的構(gòu)象。 在第四章中，采用紫外、熒光、同步熒光和三維熒光光譜法研究了4-硝基苯胺與血清白蛋白的相互作用。利用熒光光譜法研究了不同溫度下4-硝基苯胺對牛血清白蛋白和人血清白蛋白的猝滅情況，采用Stem-Volmer方程和雙對數(shù)方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并利用熱力學(xué)公式研究了4-硝基苯胺與蛋白作

11、用的熱力學(xué)參數(shù)及主要作用力的類型。采用Forster 非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計算了4硝基苯胺與牛血清白蛋白和人血清白蛋白結(jié)合時結(jié)合位置與蛋白質(zhì)分子中熒光發(fā)射基團(tuán)之間的距離。采用紫外光譜法探討了4-4硝基苯胺對血清蛋白構(gòu)象的影響。采用同步熒光光譜法和三維熒光光譜法探討了4-硝基苯胺對血清蛋白構(gòu)象的影響。研究中發(fā)現(xiàn)4-硝基苯胺與血清蛋白發(fā)生作用生成了新的復(fù)合物。其猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅，同時伴隨非輻射能量轉(zhuǎn)移。確定4-硝基苯胺與血清蛋白有一個結(jié)合位

12、點，其結(jié)合常數(shù)數(shù)量級為10<'4>L·mol<'-1>。4-硝基苯胺與血清蛋白相互作用過程是一個熵增加、吉布斯自由能降低的自發(fā)超分子作用過程，二者之間主要靠靜電作用力和疏水作用力結(jié)合。4-硝基苯胺與牛血清蛋白的結(jié)合距離為3.87nm；4-硝基苯胺與人血清白蛋白中色氨酸殘基結(jié)合位置距離為3.76rim。4-硝基苯胺對血清蛋白中的色氨酸和酪氨酸殘基均具有猝滅作用，并使得色氨酸殘基附近極性降低，疏水環(huán)境增強(qiáng)。4-硝基苯胺與血清蛋白的結(jié)合位點更

13、接近于色氨酸殘基。三維熒光光譜進(jìn)一步證明了4-硝基苯胺的加入使血清白蛋白的色氨酸殘基所處的微環(huán)境極性減弱，破壞了血清白蛋白的有序結(jié)構(gòu)，使得整個大分子更趨向于折疊態(tài)。第五章中采用紫外、熒光、同步熒光和三維熒光光譜法研究了2，4-二硝基苯胺與牛血清白蛋白的相互作用。采用熒光方法中常用的Stem-Volmer方程和雙對數(shù)方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計算了2，4-二硝基苯胺與牛血清白蛋白結(jié)合時結(jié)合位置與蛋白質(zhì)分子中熒

14、光發(fā)射基團(tuán)之間的距離。采用紫外光譜法研究了不同濃度的2,4-二硝基苯胺對血清蛋白紫外吸收光譜的影響。采用同步熒光光譜法和三維熒光光譜法探討了2,4-二硝基苯胺對血清蛋白構(gòu)象的影響。研究中發(fā)現(xiàn)2,4-二硝基苯胺與血清蛋白發(fā)生作用生成了新的復(fù)合物。其猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅，同時伴隨非輻射能量轉(zhuǎn)移。確定2,4-二硝基苯胺與BSA的結(jié)合位點數(shù)為1.17，2,4-二硝基苯胺與牛血清蛋白的結(jié)合距離為為3.13nm。2,4-二硝基苯胺對牛血清蛋白中的色氨

15、酸和酪氨酸殘基均具有猝滅作用，并使得酪氨酸殘基附近極性降低，疏水環(huán)境增強(qiáng)。三維熒光光譜進(jìn)一步證明了4-硝基苯胺的加入破壞了血清白蛋白的有序結(jié)構(gòu)，使得整個大分子更趨向于折疊態(tài)。 第六章中，采用熒光光譜法分別研究了不同溫度下十六烷基三甲基溴化銨CTAB及十二烷基苯磺酸鈉SDBS與牛血清白蛋白的作用。采用紅外光譜法研究了十六烷基三甲基溴化銨對牛血清白蛋白構(gòu)象的影響。研究中發(fā)現(xiàn)CTAB和SDBS均對BSA內(nèi)源熒光具有熒光猝滅作用。但兩者