2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、為了研究禽類多瘤病毒(Avian polyomavirus,APV)晚期基因多順反子翻譯起始調(diào)控機(jī)制,Agno-1a前導(dǎo)蛋白對下游VPs蛋白合成的調(diào)控機(jī)制的影響作用。設(shè)計構(gòu)建一系列新型cDNA重組病毒,在agno-1a mRNA編碼序列的ATG區(qū)域,設(shè)計插入一個和插入兩個含有ATG的最佳翻譯起始信號的7個氨基酸in-frame片段。在agno-1a編碼mRNA序列的ATG區(qū)域,設(shè)計PCR點(diǎn)突變,使起始密碼子ATG變成ACG或CTG,從而

2、關(guān)閉agno-1a的翻譯并可能改變關(guān)鍵mRNA二級結(jié)構(gòu),形成ATG突變型重組克隆。片段插入型克?。篠DS堿裂解法,提取APV cDNA克隆pHL1003質(zhì)粒DNA,用限制性內(nèi)切酶Acc I部分酶切,得到回收的載體片段,人工合成的27bp DNA并磷酸化的目的片段,經(jīng)T4連接酶與載體片段連接,篩選陽性重組質(zhì)粒,通過測序驗證,得到片段插入型 cDNA克隆 pHL1003+1、pHL1003+2。點(diǎn)突變型克?。河孟拗菩詢?nèi)切酶 Nco I完全酶

3、切和Acc I部分酶切pHL1003質(zhì)粒DNA,得到載體片段,設(shè)計PCR點(diǎn)突變起始密碼子ATG變?yōu)锳CG和CTG的目的片段,與載體片段連接,篩選陽性克隆測序驗證。設(shè)計構(gòu)建GFP為下游報告基因熒光標(biāo)記的APV-1晚期基因真核雙順反子表達(dá)載體,以 EGFP報告基因替代野生型病毒 APV-1編碼晚期結(jié)構(gòu)蛋白 VPs基因的堿基序列。pHL1003質(zhì)粒DNA為模板,PCR擴(kuò)增出與野生型病毒APV-1相同的Ori區(qū)、早期編碼區(qū)和晚期 agno-1a

4、區(qū)序列,作為載體片段,載體片段黏性末端補(bǔ)齊平末端連接后,得到重組質(zhì)粒pHL1003-1(可作為Agno-1a蛋白表達(dá)質(zhì)粒)。質(zhì)粒DNA pEGFP-N1為模板, PCR擴(kuò)增出編碼綠色熒光蛋白的EGFP片段,作為目的片段與上述載體片段經(jīng)T4連接酶連接,構(gòu)成重組質(zhì)粒pHL1003-GFP,測序驗證。用限制性內(nèi)切酶NruI和NedI雙酶切 pHL1003+1、pHL1003+2和 pHL1003-GFP,得到目的片段和載體片段連接,構(gòu)建pHL

5、1003+1-GFP,pHL1003+2-GFP克隆。
  本研究通過磷酸鈣和脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染方法,將構(gòu)建的cDNA突變型質(zhì)粒DNA,分別定量轉(zhuǎn)染到雞胚和鵪鶉胚胎成纖維細(xì)胞中,分別利用Western blot和熒光顯微鏡觀察檢驗。Western blot結(jié)果顯示出部分特異性條帶,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染72 h后的雞胚和鵪鶉胚胎成纖維細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功胚胎細(xì)胞明顯表達(dá)較強(qiáng)的熒光。結(jié)果表明,GFP熒光標(biāo)記的APV-1真核雙順反子 cDNA表達(dá)載體

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