水通道蛋白AqpSS9的無細(xì)胞表達(dá)和功能表征.pdf

1、水通道蛋白對水分子具有很強(qiáng)的滲透性和選擇性，在廢水回收和海水淡化等領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價值。本論文對來源于深海嗜壓菌Photobacterium pro fun-dum SS9的水通道蛋白AqpSS9進(jìn)行了無細(xì)胞表達(dá)及其功能分析，并進(jìn)一步將其制成嵌有蛋白的仿生膜。在過程中，比較分析了AqpSS9與大腸桿菌水通道蛋白AqpZ性能的異同。
　　建立了AqpSS9的大腸桿菌無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了無細(xì)胞表達(dá)載體pIVEX2.4c-AqpSS

2、9，著重研究了去污劑重懸(P-CF)、直接在無細(xì)胞反應(yīng)中添加去污劑(D-CF)和直接在無細(xì)胞反應(yīng)中添加脂質(zhì)體(L-CF)三種不同模式下，制備可溶性AqpSS9的可行性。
　　選用方便快捷的D-CF模式。當(dāng)去污劑Brij-78濃度為0.7％時AqpSS9的可溶表達(dá)量達(dá)到最大值（565μg/mL）。采用鎳柱親和層析純化可溶表達(dá)的AqpSS9，將其重構(gòu)到DOPC脂質(zhì)體中得到AqpSS9脂蛋白體，其嵌入率為55％。用停留光譜(stoppe

3、d-flow)檢測AqpSS9脂蛋白體的透水功能，其水通透因子Pf值為310.7±3.2μm/s，約是對照組未嵌入AqpSS9的空脂質(zhì)體（89.3±1.8μm/s）的3.5倍。AqpSS9的蛋白單體水通透因子Pf,mono值為2.25×10-20 m3/s。AqpSS9脂蛋白體和對照空脂質(zhì)體的NaCl阻滯率σ值分別為0.79和0.83。
　　構(gòu)建無細(xì)胞表達(dá)載體pIVEX2.4c-AqpZ。在標(biāo)準(zhǔn)無細(xì)胞體系中添加1.0％Brij-7

4、8可溶表達(dá)AqpZ，表達(dá)量為490μg/mL。采用鎳柱親和層析純化AqpZ，并將其重構(gòu)到DOPC脂質(zhì)體中，其嵌入率為57％。用stopped-flow檢測AqpZ脂蛋白體的透水功能，其水通透因子Pf值為258.1±8.9μm/s，約是對照組未嵌入AqpZ的空脂質(zhì)體（92.3±1.2μm/s）的2.8倍。AqpZ的蛋白單體水通透因子Pf,mono值為0.9×10-20 m3/s。結(jié)果表明，AqpSS9的透水功能與AqpZ相當(dāng)。
　　

5、采用靜電吸附、層層自組裝的方法制備含水通道蛋白的仿生膜。分別采用截流反滲透實驗和正滲透實驗，對按一定質(zhì)量比例嵌入AqpSS9和AqpZ的兩種磷脂仿生膜進(jìn)行水通量和截鹽率等性能分析。并進(jìn)一步對采用商業(yè)化聚丙烯腈底膜的仿生膜進(jìn)行了反滲透實驗，對照分析了分別嵌入AqpSS9、AqpZ和AqpZ-Mutant（AqpZ突變體）的三種含水通道蛋白仿生膜的性能。結(jié)果表明，水通道蛋白的嵌入都明顯提高了仿生膜的水通量，截鹽率能得到保持并有略微提高。嵌入