基于新型信號檢測技術(shù)的蛋白激酶活性分析方法研究.pdf

1、蛋白激酶在細(xì)胞的增殖、分化、代謝、凋亡等生理過程的調(diào)控中起著十分重要的作用。其活性的異常會導(dǎo)致許多疾病的產(chǎn)生，因此對蛋白激酶活性的分析與研究對于臨床診斷以及靶向藥物的研制都具有重要的意義。相關(guān)領(lǐng)域的研究迫切需要開發(fā)靈敏度高、特異性好、操作簡單、成本低廉的檢測蛋白激酶活性的新方法。本論文以蛋白激酶 A（PKA）為研究對象，采用Zr4+修飾的功能化磁性微球為磷酸化多肽識別載體，創(chuàng)新性利用上轉(zhuǎn)換熒光以及便攜式血糖儀等新型信號檢測機(jī)制，建立了靈

2、敏檢測蛋白激酶活性的方法。主要研究內(nèi)容如下：
　　1.將Zr4+修飾在Fe3O4/SiO2磁性微球表面。生物素（Biotin）標(biāo)記的底物多肽在蛋白激酶存在時特定的氨基酸殘基將被磷酸化，多肽上的磷酸基團(tuán)與Zr4+特異性結(jié)合，而被富集在磁性微球表面；同時多肽一端標(biāo)記的 biotin與表面標(biāo)記有親和素（Avidin）的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子特異性結(jié)合。因此，蛋白激酶的活性與磁性微球上富集的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子呈正比關(guān)系。通過對磁性微球表面的磷

3、酸化多肽進(jìn)行洗脫并檢測溶液中的上轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度，即可實現(xiàn)蛋白激酶活性的高靈敏度檢測。該方法對蛋白激酶活性檢測范圍為0.05 mU/μL到0.2 U/μL；檢出限為0.02 mU/μL。
　　2.基于常用的便攜式血糖儀，建立了一種簡單、快速測定蛋白激酶活性的方法。同樣以 Zr4+修飾的磁性微球為磷酸化多肽富集載體，在其表面富集蛋白激酶催化產(chǎn)生的biotin-磷酸化多肽，經(jīng)由鏈霉親和素（Streptavidin）介導(dǎo)而進(jìn)一步捕獲 bio