納米材料信號(hào)增強(qiáng)電化學(xué)-電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白激酶.pdf

1、蛋白質(zhì)磷酸化在新陳代謝、細(xì)胞信號(hào)通訊、細(xì)胞增殖與分化等生命活動(dòng)中起著非常重要的作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有高達(dá)30％的人類蛋白要經(jīng)過蛋白激酶的修飾，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理生化功能。而異常的蛋白質(zhì)磷酸化與許多疾病密切相關(guān)，如許多慢性炎癥性疾病、癌癥、糖尿病和老年性癡呆等。因此，了解蛋白激酶的作用機(jī)理并找出有潛在功能的抑制劑，對(duì)疾病的診斷、治療和藥物的研發(fā)具有非常重要的指導(dǎo)意義。傳統(tǒng)的蛋白激酶活性檢測(cè)方法有很多，盡管這些方法很有效，但大多具有操作復(fù)雜、靈敏

2、度不高、需放射性標(biāo)記、需昂貴儀器等缺點(diǎn)，所以發(fā)展新的蛋白激酶活性分析方法是十分必要的。電化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光生物傳感器具有裝置簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)而受到研究者們的廣泛關(guān)注。特別是隨著納米技術(shù)的發(fā)展，各種功能化納米材料被逐漸引入電化學(xué)及電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的構(gòu)建。由于納米材料本身所具備的小尺寸效應(yīng)、大比表面積、良好的生物相容性和表面易修飾等優(yōu)良特性，尤其是在檢測(cè)DNA、蛋白質(zhì)、小分子等方面所表現(xiàn)出的信號(hào)增強(qiáng)效應(yīng)，為電化學(xué)及電化學(xué)發(fā)光

3、生物傳感器性能的進(jìn)一步改善和優(yōu)化帶來了新契機(jī)。基于此，本論文以發(fā)展蛋白激酶分析新方法為目標(biāo)，利用納米材料信號(hào)增強(qiáng)作用，構(gòu)建新型電化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，開展了蛋白激酶活性及其抑制劑相關(guān)研究，主要包括以下兩個(gè)方面的工作：
　　一、基于TiO2/MWNTs納米復(fù)合物免標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)酪蛋白激酶2活性
　　利用TiO2/MWNTs納米復(fù)合物發(fā)展了一種免標(biāo)記分析酪蛋白激酶2(CK2)活性以及相關(guān)抑制劑的電化學(xué)方法。該方法利用TiO

4、2納米顆粒能特異性結(jié)合磷酸基團(tuán)和MWNTs能加快電子傳遞速率的特性來實(shí)現(xiàn)CK2活性的靈敏檢測(cè)。首先將合成的TiO2/MWNTs納米復(fù)合物修飾在玻碳電極表面，其中MWNTs既可以增加電極的比表面積，還可以加速電子傳遞。在ATP存在的條件下，CK2催化底物肽磷酸化，將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物肽的絲氨酸殘基上。由于磷酸基團(tuán)能與TiO2納米顆粒特異性結(jié)合，使磷酸化的底物肽結(jié)合到被TiO2/MWNTs納米復(fù)合物質(zhì)修飾的玻碳電極表面，形成肽絕緣層。在電極

5、表面形成的肽絕緣層使氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-不易靠近電極表面從而使峰電流下降，下降的峰電流大小與CK2濃度成響應(yīng)關(guān)系，這提供了一種新型傳感策略來監(jiān)控底物肽的磷酸化。該設(shè)計(jì)能實(shí)現(xiàn)CK2活性的免標(biāo)記分析，得到的檢測(cè)限為0.07U/mL，線性響應(yīng)濃度范圍為0 U/mL～0.5 U/mL。同時(shí)，該方法還被用于對(duì)CK2的抑制實(shí)驗(yàn)和干擾實(shí)驗(yàn)研究。
　　二、基于磷酸化聯(lián)吡啶釕二氧化硅納米顆粒信號(hào)增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白激酶A活性<

6、br>　　結(jié)合磷酸化聯(lián)吡啶釕二氧化硅納米顆粒(Rubpy-PSiNPs)的信號(hào)產(chǎn)生和增強(qiáng)作用，發(fā)展了一種免標(biāo)記且高靈敏分析蛋白激酶A(PKA)活性和抑制劑的電化學(xué)發(fā)光方法。首先通過溶膠-凝膠法合成了Rubpy-PSiNPs。當(dāng)ATP存在時(shí)，修飾在金電極上的底物肽經(jīng)PKA催化將磷酸基團(tuán)引入到底物肽的絲氨酸殘基上。由于Zr4+能與兩個(gè)磷酸基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，從而介導(dǎo)磷酸化底物肽與Rubpy-PSiNPs之間的連接，使Rubpy-PSiNPs結(jié)合到