電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

1、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,11月 劉博,免疫分析法發(fā)光和化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光免疫分析法電化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光免疫分析法甲狀腺功能介紹,免疫分析,基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測的一種手段；免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。,免疫學(xué)檢測歷史演進(jìn),放射免疫檢測（現(xiàn)仍普遍使用于縣級以上醫(yī)院

2、）；酶聯(lián)免疫檢測（各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測技術(shù),發(fā)光分類,光照發(fā)光:發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光（熒光）。生物發(fā)光：指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，比如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物熒光素在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復(fù)到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出?；瘜W(xué)發(fā)光（生物體內(nèi)各種現(xiàn)象都與化學(xué)反應(yīng)有關(guān)，都屬于化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象

3、）,化學(xué)發(fā)光,化學(xué)發(fā)光是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象，某些特殊的化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)的中間體或產(chǎn)物由于吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能而處于電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回到基態(tài)時以發(fā)射光子的形式釋放能量。,化學(xué)發(fā)光分析,根據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在某一時刻的發(fā)光強(qiáng)度或反應(yīng)的發(fā)光總量來確定反應(yīng)中相應(yīng)組分含量的分析方法，稱為化學(xué)發(fā)光分析。,化學(xué)發(fā)光分析優(yōu)點,化學(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時不需要激發(fā)光，就避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響有很高的靈敏度，并且不像放

4、射分析那樣存在環(huán)境污染和健康危害,化學(xué)發(fā)光分析缺點,雖然化學(xué)發(fā)光具備很高的特異性和很小的干擾，但化學(xué)分析本身的不特異性，制約了整個方法的使用。,化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）,CLIA是將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性。,化學(xué)發(fā)光免疫分析（ CLIA）分類,按標(biāo)志物的不同及反應(yīng)原理的不同分為直接化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 電化學(xué)發(fā)光免疫分

5、析,電化學(xué)發(fā)光,電化學(xué)發(fā)光（ECL）是通過在電極上施加一定的波形電壓或電流信號進(jìn)行點解反應(yīng)的產(chǎn)物之間或與體系中共存組反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象,定義:指通過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)特點： 反應(yīng)在電極進(jìn)行 化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)吡啶釕 電子供體為：三丙胺,電化學(xué)發(fā)光劑,電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLI),ECLI是繼EIA、RIA、FIA、時間分辨熒光免疫技術(shù)之后的新一代標(biāo)記免疫測定技術(shù)； ECLI是電化

6、學(xué)發(fā)光(ECL)和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物；ECLI是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測定技術(shù)之一。,ECLI原理,在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記Ab(Ag),通過Ag-Ab反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對待測的Ag或Ab進(jìn)行定量或定性分析。,,ECLIA特點,三聯(lián)吡啶釕在電場中不斷得到電子，可持續(xù)發(fā)光，信號強(qiáng)度高，容易測定容易控制三聯(lián)吡啶釕直接標(biāo)記抗原或抗體，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標(biāo)志物

7、的理化特性試劑靈敏度高，穩(wěn)定性好,ECLIA優(yōu)越性,高度敏感，可達(dá)pg／ml或pmol水平；特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，CV＜5％。測定范圍寬，可達(dá)7個數(shù)量級。試劑靈敏度高，穩(wěn)定性好，無毒害，無污染，有效期長，達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年。操作簡單，耗時短，易于自動化。,臨床應(yīng)用,由于該技術(shù)無放射性污染，同時有放射免疫測定的靈敏度，且具有快速、準(zhǔn)確、特異、可自動化等特點，廣泛應(yīng)用于以下幾個方面:激素:甲狀腺激素、生殖激素、垂體激素和皮質(zhì) 激

8、素腫瘤標(biāo)記物:AFP、CEA、PSA、CA199、CA125、CA153等貧血因子:VB12、葉酸、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等糖尿病:胰島素、血清C-肽、血漿胰高血糖素等,感染性疾病:衣原體抗體、弓形蟲抗體、風(fēng)疹病毒抗體等其它如一些心臟標(biāo)志物、病毒標(biāo)志物、治療藥物的監(jiān)測等,甲狀腺功能項目： 促甲狀腺素（TSH）、 游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、 游離甲狀腺素(FT4)、 三碘甲狀腺原氨酸（T3）、 甲狀腺素（T4）、 抗

9、甲狀腺球蛋白抗體（Anti-TG)、 抗甲狀腺過氧化物酶抗體（Anti-TPO)。,游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）,介紹：T3是由甲狀腺濾泡細(xì)胞合成及分泌的激素。FT3約占T3的0.5%,能透過細(xì)胞膜進(jìn)入組織細(xì)胞，發(fā)揮生理效應(yīng)，其濃度與組織中的三碘甲狀腺原氨酸濃度一致，也與機(jī)體代謝狀態(tài)一致，對非甲狀腺疾病也有診斷價值。臨床意義： 增高：見于甲亢、三碘甲狀腺原氨酸型甲狀腺功能亢進(jìn)。 降低：見于甲狀腺功能減退。正常參考

10、值：2.0-4.4pg/ml,游離甲狀腺素（FT4）,介紹：血清游離甲狀腺素是甲狀腺功能體外試驗的靈敏指標(biāo)，即使在生理情況下引起血漿甲狀腺素結(jié)合蛋白結(jié)合力和濃度改變時，也能較準(zhǔn)確反映甲狀腺的功能。臨床意義： 增高：甲狀腺中毒癥、突眼性甲狀腺功能亢進(jìn)癥、無痛性甲狀腺炎伴甲亢、亞急性甲狀腺炎伴甲亢、甲狀腺制劑服用過量、甲狀腺受體不應(yīng)癥、慢性甲狀腺炎伴甲亢。 降低：甲狀腺功能減退(原發(fā)性)、垂體性或者無痛性亞急性甲狀腺炎的

11、一過性功能減退期、低白蛋白血癥。 正常參考值：0.93～1.70ng／dL,促甲狀腺激素（TSH）：,介紹：促甲狀腺激素是腺垂體分泌的促進(jìn)甲狀腺的生長和機(jī)能的激素，具有促進(jìn)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生、甲狀腺激素合成和釋放的作用。臨床意義： 增高：原發(fā)性甲狀腺功能減退、伴有甲狀腺功能低下的橋本病、亞急性甲狀腺炎恢復(fù)期。攝人金屬鋰、碘化鉀、促甲狀腺激素釋放激素可使促甲狀腺激素增高。 降低：垂體性甲狀腺功能低下、非促甲狀腺激素

12、瘤所致的甲狀腺功能亢進(jìn)，以及攝入阿司匹林、皮質(zhì)激素及靜脈使用肝素可使促甲狀腺激素降低。正常參考值：0.27～4.20uIU／mL,總?cè)饧谞钕僭彼?TT3)：,介紹：10%～20%T3由甲狀腺合成與釋放，80%～90%來自于周圍組織T4的脫碘轉(zhuǎn)化成T3。T3為主要發(fā)揮生物活性的甲狀腺激素。血清中T3的絕大多數(shù)(99.5%)與血漿中特異蛋白結(jié)合，僅極少數(shù)處于游離狀態(tài)(0.5%)。血清中TT3濃度的改變，表示甲狀腺功能的異常，TT3濃度

13、的改變常和TT4平行，但有時存在差異，如T4型甲亢，TT3則正常。因此，臨床上常同時測定TT3和TT4值。臨床意義：增高：TT3是診斷甲狀腺功能亢進(jìn)(甲亢)最靈敏的指標(biāo)，甲亢時TT3可高出正常值4倍；同時TT3是診斷T3型甲亢的特異性指標(biāo)。降低：常見于甲狀腺功能減低(甲減)。正常參考值：血清TT3值與年齡有關(guān)，出生后TT3水平高于正常成人，5歲后隨年齡增長逐漸下降，老年人TT3常低于正常人。成人：0.73～2.88ng/ml。,

14、總甲狀腺激素(TT4)：,介紹：TT4是甲狀腺分泌的主要產(chǎn)物，也是構(gòu)成下丘腦-垂體前葉-甲狀腺調(diào)節(jié)系統(tǒng)完整性不可缺少的成份。TT4測定可用于甲亢、原發(fā)性和繼發(fā)性甲減的診斷以及TSH抑制治療的監(jiān)測。臨床意義： 增高：甲亢，急性甲狀腺炎，亞急性甲狀腺炎，急性肝炎，肥胖癥，應(yīng)用甲狀腺激素時，進(jìn)食富含甲狀腺激素的甲狀腺組織等。 降低：甲減，全垂體功能減退癥，下丘腦病變，劇烈活動等。正常參考值：5.10-18.00ug/dl,

15、抗甲狀腺過氧化物酶自身抗體 （TPOAb） ：,介紹：甲狀腺過氧化物酶是甲狀腺微粒體的主要抗原成分，其功能與甲狀腺素的合成有關(guān)?？辜谞钕龠^氧化物酶抗體或抗甲狀腺微粒體抗體可能使甲狀腺細(xì)胞損傷。檢測抗甲狀腺過氧化物酶抗體的方法與抗甲狀腺球蛋白抗體類似。測定抗甲狀腺過氧化物酶抗體的臨床意義與抗甲狀腺球蛋白抗體也大致相同，主要對于慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、原發(fā)性甲狀腺功能減退癥，有輔助診斷、療效考核價值。 臨床意義：橋本

16、(Hashimoto)甲狀腺炎患者血清中ATG檢出率可達(dá)90%～95%;甲狀腺功能亢進(jìn)患者檢出率40%～90%不等，檢出率高的可能與部分病例屬于橋本甲亢有關(guān);原發(fā)性甲狀腺功能低下癥患者檢出率65%左右。 參考值：0.00-34.00IU/mL,抗甲狀腺球蛋白抗體（Anti-TG),介紹：甲狀腺球蛋白是一種潛在的自身抗原，當(dāng)進(jìn)入血液后可刺激機(jī)體產(chǎn)生Anti-TG抗體。 Anti-TG，測定有助于診斷自身免疫疾病。臨床意義：在

17、自身免疫性甲狀腺炎患者中可發(fā)現(xiàn)Anti-TG抗體濃度升高出現(xiàn)頻率大約是70%-80%。Graves病Anti-TG抗體的陽性率約60%，經(jīng)治療后滴度下降提示治療有效。甲亢病人測Anti-TG陽性且滴度較高，提示抗甲狀腺藥物療效果不佳，且停藥后易復(fù)發(fā)。參考值：0.00-115.00IU/ml,異常值處理：,TSH>10uUI/ml 時應(yīng)進(jìn)行1：10稀釋重做。TPO>600IU/ml時應(yīng)進(jìn)行1：5稀釋重做。出現(xiàn)單個項目過高