一體化生物加工過程進(jìn)行大腸桿菌的半纖維素琥珀酸生產(chǎn).pdf

1、一體化生物加工過程進(jìn)行大腸桿菌的半纖維素琥珀酸生產(chǎn)一體化生物加工過程進(jìn)行大腸桿菌的半纖維素琥珀酸生產(chǎn)EngineeringEscherichiacolifsuccinateproductionfromhemicelluloseviaconsolidatedbioprocessing（國家自然科學(xué)基金項目資助NSFC21176182）（國家973計劃項目資助NO.2011CBA00804，2012CB725203）一級學(xué)科：化學(xué)工程與技術(shù)

2、學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：鄭宗寶指導(dǎo)教師：趙學(xué)明教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一二年六月中文摘要中文摘要復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及解聚所需的高成本是阻礙半纖維素作為底物進(jìn)行生物燃料和生物化學(xué)品生產(chǎn)的主要障礙。一體化生物加工過程（ConsolidatedBioprocessingCBP）通過利用一種微生物同時行使水解酶的生產(chǎn)，生物質(zhì)原料的降解以及生物產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化這三大功能，能夠顯著降低木質(zhì)纖維素原料包括半纖維素利用過程的成本。在本文中，通過借鑒代謝工程與合成生

3、物學(xué)的基本原理與思想，改造大腸桿菌使其表達(dá)分泌三種半纖維素酶，實現(xiàn)了直接以山毛櫸木聚糖為底物進(jìn)行琥珀酸生產(chǎn)的生物轉(zhuǎn)化過程。木聚糖酶的胞外分泌是通過與OsmY蛋白的融合實現(xiàn)的。將十二個不同來源的并與OsmY融合的木聚糖內(nèi)切酶木糖苷酶組合進(jìn)行酶學(xué)表征，選擇出一組具有最優(yōu)酶學(xué)特性的木聚糖酶組合，即來自于FibrobactersuccinogenesS85的木聚糖內(nèi)切酶XynCA以及來自于Fusariumgraminearum的木糖苷酶Xylo

4、A。在該菌株中，木聚糖酶誘導(dǎo)表達(dá)8h時，即可向胞外分泌0.180.01gl的蛋白質(zhì)，木聚糖內(nèi)切酶活性為12.140.34Umg，木糖苷酶活性為923mUmg。隨后通過一系列措施來進(jìn)一步優(yōu)化木聚糖酶的表達(dá)分泌，以提高其水解效率，更好的滿足CBP生產(chǎn)的需要，包括敲除大腸桿菌Braun’slipoprotein的編碼基因lpp；過表達(dá)催化二硫鍵形成的氧化還原酶編碼基因dsbA；優(yōu)化木聚糖酶表達(dá)載體的表達(dá)水平；通過Blc蛋白于外膜表面展示木糖苷

5、酶；過表達(dá)來自于枯草芽孢桿菌168的阿拉伯糖苷酶編碼基因abf2等。將半纖維素水解能力與一株琥珀酸高產(chǎn)菌進(jìn)行整合，實現(xiàn)了在沒有提供外部木聚糖水解酶及任何有機(jī)組分的情況下直接以木聚糖為底物進(jìn)行琥珀酸的生產(chǎn)。由此構(gòu)建的大腸桿菌菌株Z6373在厭氧條件下以木聚糖為底物，可以得到0.37gg的琥珀酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了以木聚糖酸水解液為底物時的76%。本文通過表達(dá)和分泌三種半纖維素酶成功的建立起一個大腸桿菌以木聚糖為底物進(jìn)行琥珀酸生產(chǎn)的CBP系統(tǒng)。本