TnGV ENHANCIN原核表達產(chǎn)物功能驗證及真核表達.pdf

1、增效蛋白(Enhancin)是一類主要由昆蟲桿狀病毒基因編碼金屬蛋白酶，分子量大小約89～110KDa，它通過破壞昆蟲中腸圍食膜的完整結(jié)構(gòu)，加速病毒粒子的侵入，從而提高生物殺蟲劑對害蟲的感染效率。
　　 為了尋找和確定增效蛋白在昆蟲中腸圍食膜上的靶標(biāo)蛋白和進一步揭示Enhancin蛋白的增效機制，本研究設(shè)計如下：以粉紋夜蛾顆粒體病毒(TnGV)的增效蛋白Tn-En為研究對象，體外擴增獲得目的基因，并進行原核表達。通過SDS-PA

2、GE、Western blot和Ni+親和層析驗證目的蛋白。利用初步純化的增效蛋白進行生物測定，并提取棉鈴蟲5齡幼蟲的圍食膜進行增體外酶解實驗。構(gòu)建重組桿狀病毒真核表達載體：Bacmid-pFastBac-En和含有報道基因EGFP的真核表達載體Bacmid-pFastBac-En-EGFP，轉(zhuǎn)染昆蟲細胞Sf9，實現(xiàn)目的基因的真核表達，通過SDS-PAGE和Western blot技術(shù)進行驗證。
　　 Tn-En基因的原核表達成

3、功，生物測定結(jié)果顯示3VE可以提高死亡率23.34％，4VE提高死亡率22.22％，5VE提高死亡率1.67％。體外降解實驗發(fā)現(xiàn)圍食膜上某種大分子量的蛋白可以被增效蛋白降解。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Bacmid-pFastBac-En-EGFP的細胞在倒置熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光存在，電泳及雜交證明融合蛋白真核表達成功，為非分泌型蛋白。重組基因Bacmid-pFastBac-En經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示在真核系統(tǒng)中表達成功。