兩種蜘蛛的毒素基因克隆和表達(dá).pdf

1、研究背景:
　　 當(dāng)前，對(duì)蜘蛛毒素的生物功能及其作為藥物先導(dǎo)分子在藥理學(xué)研究中應(yīng)用的探索，越來(lái)越受到天然藥物開(kāi)發(fā)研究者的重視。但是，天然毒液的產(chǎn)量較小這一問(wèn)題，一直制約著其功能和活性的研究進(jìn)展。為此，探索合成或者生產(chǎn)蜘蛛毒素的簡(jiǎn)便易行的方法，已經(jīng)是當(dāng)前該領(lǐng)域研究者亟待解決的問(wèn)題。虎紋捕鳥(niǎo)蛛（Ornithoctonus huwena）是分布在華南山區(qū)的一種體型較大的毒蜘蛛。目前已從其毒液中分離出多種蛋白質(zhì)和多肽，并且已經(jīng)鑒定部分蛋

2、白質(zhì)和多肽的生物活性。其中，多肽DkTx(double-knot toxin)可以通過(guò)刺激細(xì)胞膜外側(cè)孔區(qū)域激活辣椒素受體和瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（TRPV1）通道，促進(jìn)降鈣素相關(guān)肽的釋放，進(jìn)而起到舒血管及降血壓的作用。森林漏斗蛛(Agelena silvatica)是漏斗蛛科蜘蛛中，毒液毒性較小的蜘蛛，廣泛分布在我國(guó)南北方的山林和草原地區(qū)，其可利用毒液麻痹昆蟲(chóng)進(jìn)行捕食。目前，國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有對(duì)該種蜘蛛的毒素研究，缺乏相關(guān)的數(shù)據(jù)，本研究將填補(bǔ)

3、這些數(shù)據(jù)的空白。
　　 研究目的:
　　 1、篩選DkTx的類(lèi)似物，并進(jìn)行功能分析。
　　 2、構(gòu)建森林漏斗蛛毒腺的cDNA文庫(kù)，篩選新的毒素基因。
　　 研究方法:
　　 1、設(shè)計(jì)引物，在虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒腺cDNA文庫(kù)中，通過(guò)PCR擴(kuò)增出目的基因。將目的基因構(gòu)建至表達(dá)載體pVT102U/α，利用釀酒酵母S-78株進(jìn)行表達(dá)，并將表達(dá)產(chǎn)物分離純化、鑒定。
　　 2、取森林漏斗蛛毒腺，利用Crea

4、torTM SMARTTM cDNA LibraryConstruction Kit構(gòu)建cDNA文庫(kù)，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增篩選新的毒素基因。
　　 研究結(jié)果
　　 1、在虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒腺的cDNA文庫(kù)中，成功篩選出4種DkTx類(lèi)似物: FR+T3F34+P-5、 FR+T3F34+P-6、 FR+T5R32+P-8、FR+T5R32+P-105。并通過(guò)釀酒酵母S-78株表達(dá)了DkTx類(lèi)似物，其中FR+T5R32+P-8

5、的氨基酸序列得以正確表達(dá)。
　　 2、通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)，篩選出5種cDNA序列:D7、D82、D134、D523、D787。其中D7、D134、D523、D787為新的蜘蛛毒素基因;D82與Agelenopsis aperta的蜘蛛毒素Toxin_7超家族的序列完全相同。
　　 結(jié)論:
　　 1、成功篩選了4種DkTx的類(lèi)似物，并通過(guò)釀酒酵母表達(dá)。
　　 2、通過(guò)構(gòu)建森林漏斗蛛cDNA文庫(kù)，成功克隆出