甲型流感PB1-F2分子特征及與人IFITM3基因關聯(lián)性的研究.pdf

1、研究目的:
　　目前人流感的主要型別為甲型流感和乙型流感，其中甲型流感主要有季節(jié)性H3N2、甲型H1N1，人感染H7N9禽流感散在發(fā)生，相較于乙型流感，甲型流感具有罹患率高、重癥率高、死亡人數(shù)多等特點，抗原漂移和抗原轉換使病毒不斷免疫逃逸，從而人群中引起大范圍的傳播和流行。甲型流感病毒的PB1-F2蛋白是病毒重要的毒力因子，在病毒的感染致病過程中發(fā)揮重要作用。除病毒因素外，宿主個體遺傳性差異也是影響流感患者臨床結局的重要因素，IF

2、ITM3功能障礙往往預示患者的不良結局。本研究收集江寧醫(yī)院呼吸科甲型流感住院病例，分析了甲型流感病毒PB1-F2蛋白的遺傳變異特征和進化趨勢，并分析了IFITM3基因rs12252位點各基因型在病例及對照中的分布，探討IFITM3基因多態(tài)性與流感易感性的關聯(lián)，欲從病毒與宿主遺傳易感性兩個方面探討甲型流感可能的致病作用。此外，本研究分析了甲型流感的細胞因子及血液生化指標的改變及臨床意義，為甲流的后續(xù)研究提供科學依據(jù)。
　　研究方法:

3、
　　1.咽拭子進行核酸提取和實時熒光定量PCR檢測、鑒定分型，甲型流感陽性標本進行病毒培養(yǎng)，擴增PB1基因序列。通過NCBI流感基因數(shù)據(jù)庫，下載2016-2017年全球甲型流感病毒的PB1毒株序列，運用MEGA5.2軟件分析甲型流感PB1及PB1-F2蛋白的變異情況，采用Fasttree軟件繪制PB1基因的系統(tǒng)進化樹，通過在線軟件Datamonkey(http:/www.datamonkey.org)分析PB1序列的選擇性壓力。

4、
　　2.檢索Pubmed，Web of Science，Elsevier,中國知網(wǎng)及萬方數(shù)據(jù)庫，查找有關IFITM3基因rs12252位點多態(tài)性與流感易感性關聯(lián)的病例對照或隊列研究。分別計算病例組與對照組暴露等位基因C相對于等位基因T的比值比(odds ratio，OR)及其95％CI。應用Cochrane Q值檢驗和I2值檢驗各研究結果之間的一致性。
　　3.將核酸檢測流感陽性患者納入流感組，并分為重癥及輕癥，陰性納入流

5、感癥狀組，對照組數(shù)據(jù)來自千人基因組計劃漢族人群的結果。提取血液DNA，自行設計引物，擴增rs12252位點序列，測序鑒定基因型。采用SPSS20.0及STATA.12軟件分析對照組HWE平衡，對基因型數(shù)據(jù)構建不同遺傳模型，比較各組IFITM3(rs12252)CC和CT/TT基因型分布，探討易感基因IFITM3(rs12252)與流感的關聯(lián)。
　　4.選擇甲型流感、流感癥狀及健康者的血清標本，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組細胞因子白細

6、胞介素6(IL-6)、人白細胞介素10（IL-10）、人白細胞介素18(IL-18)、人白細胞介素1β(IL-1β)、人γ干擾素（IFN-γ）、人腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平;收集住院患者的血常規(guī)及生化36項的檢驗結果，使用Epidata3.2軟件構建數(shù)據(jù)庫，輸入細胞因子、血常規(guī)及生化檢驗結果，SPSS20.0軟件分析比較各組血液生化水平差異。
　　研究結果:
　　1.流感監(jiān)測結果:南京市2016年4月至2017年3月累

7、計報告ILI病例5621例，分離陽性毒株733例，分離陽性率為13.04％。季節(jié)性H3N2及乙型流感為主要流行株，主要流行于冬春季，5-25歲及25-60歲年齡組是流感的主要感染人群;江寧醫(yī)院采集流感樣病例咽拭子102例，19例流感陽性，陽性率18.63％,17例季節(jié)性H3N2亞型和2株乙型流感分離于冬春季，江寧地區(qū)流感流行及分布與南京地區(qū)整體分布相一致。
　　2.甲型流感PB1片段分子特征:2016-2017年全球各地區(qū)的季節(jié)性

8、H3N2亞型分離株PB1基因序列與疫苗株的同源性均較為相近，江寧地區(qū)分離株的核苷酸與氨基酸同源性分別為98.56％-98.88％，99.47％-99.74％。全球分離的甲型H1N1亞型流感病毒PB1的核苷酸、氨基酸與疫苗株A/Califomia/7/2009(H1N1)的同源性分別為97.95％-99.06％、98.93％-99.60％。全球及江寧地區(qū)H3N2分離株PB1片段均發(fā)生T152S及Y166F氨基酸位點變異，散在發(fā)生的氨基酸位

9、點變異有I181V、T257A、N328T、S375N和I667T。全球范圍的甲型H1N1亞型流感氨基酸位點均變異的有G154D、I397M、I435T，變異頻率較高的有P437L、Y467C。全球范圍H3N2流感IFEL模型篩選出正向選擇壓力位點428，江寧地區(qū)H3N2亞型流感經(jīng)FEL及REL模型篩選出正向選擇壓力位點539。H3N2流感PB1片的系統(tǒng)進化樹主要分為6個分支，江寧地區(qū)的分離株有13株位于分支Ⅲ，4株位于分支Ⅳ，甲型H1

10、N1亞型流感毒株主要進化為兩大分支。
　　3.meta分析結果:共9篇文獻納入meta分析，合計流感病例1074例，其中重癥397例，輕癥677例，健康對照3510例。IFITM3基因rs12252位點等位基因C與流感感染存在顯著關聯(lián)，等位基因模型，顯性基因及隱性基因模型結果均顯示有統(tǒng)計學意義。(C vs T:OR=1.626，95％CI:1.395-1.895;CC+CT vs TT:OR=1.680,95％CI:1.362-2

11、.072;CC vs CT+TT:OR=2.155,95％CI:1.624-2.860)。亞組分析結果顯示，在高加索人群中，攜帶C等位基因是增加感染流感風險的危險因素，并且攜帶C等位基因與輕癥及重癥流感均存在統(tǒng)計學關聯(lián)（重癥CvsT:OR=1.637，95％CI:1.039-2.579;輕癥C vs T:OR=1.373，95％CI:1.036-1.820），在亞洲人群中C等位基因與流感的重癥存在顯著關聯(lián)，與輕癥流感無關(重癥C vs

12、T:OR=2.272,95％CI:1.671-4.397;輕癥C vs T:OR=1.200,95％CI:0.928-1.553)。
　　4.IFITM3基因rs12252位點等位基因C與甲型流感的關聯(lián)性:C等位基因在東亞、非洲、美洲及歐洲人群中分布的頻率分別為52.78％、26.02％、17.72％和4.08％。本研究的甲型流感組、流感組、流感癥狀組及重癥流感組C等位基因頻率分別為52.94％、57.89％、54.22％和77.

13、78％。對照組的基因符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，具有群體代表性;C等位基因模型、顯性基因模型及隱性基因模型的結果顯示，rs12252的C等位基因與甲型流感及流感的易感性均無統(tǒng)計學關聯(lián)，而C等位基因與重癥流感顯著相關(OR=1.548，95％CI:1.187-2.019)。
　　5.甲型流感患者血清細胞因子水平改變:甲型流感病例組血清TNF-α、IL-6、IFN-γ及IL-18水平分別為(38.59±23.93)ng/

14、L、(7.75±4.37)ng/L、(22.27±14.78)ng/L及(74.70±43.80)ng/L，均顯著高于健康對照組;流感癥狀組血清TNF-α、IL-6及IFN-γ水平分別為(32.64±22.03)ng/L、(7.07±2.96)ng/L及(24.61±20.30)ng/L，均顯著高于健康對照組。
　　6.甲型流感病例血常規(guī)及生化指標改變:甲型流感患者HBG、HCT、PLT、LYM及Baso水平分別為(127.84±

15、20.10)g/L、(39.54±4.75)、(185.94±47.22)×109/L、(1.60±0.70)×109/L及(0.01±0.01)×109/L均顯著低于對照組水平，CRP水平為(28.86±24.27)mg/L，高于對照組;流感癥狀組的HBG、LYM水平分別為(132.20±17.74)g/L和(1.74±0.72)×109/L，顯著低于對照組水平，CRP水平為(43.18±51.23)mg/L，高于對照組。甲型流感病例

16、組TP、ALB水平分別為(64.27±5.23)g/L、(37.56±4.99)g/L，低于對照組，GGT水平為(38.67±10.88)U/L，顯著升高。
　　研究結論:
　　1.甲型流感病毒PB1基因片段進化較為保守，2016-2017年江寧分離的H3N2亞型流感毒株與全球其他地區(qū)的H3N2流感PB1片段進化趨勢相一致，PB1-F2蛋白斷裂型流感毒株占據(jù)一定的比例，全球的甲型H1N1亞型流感毒株均表達長度為11aa的PB

17、1-F2蛋白。未發(fā)現(xiàn)江寧地區(qū)分離株PB1-F2蛋白出現(xiàn)高致病性特征突變。其氨基酸位點變異的流行病學及臨床意義有待進一步研究考證。
　　2.meta分析結果顯示IFITM3基因的SNP位點rs12252位點C等位基因與流感的易感性相關，在高加索人群中，C等位基因與輕癥及重癥流感均相關，而在亞洲人群中，C等位基因與重癥流感相關，與輕癥流感無統(tǒng)計關聯(lián)。
　　3.本研究納入病例經(jīng)等位基因模型、顯性模型及隱性模型的分析，未發(fā)現(xiàn)甲型流感