基于TGF-β-Smad通路ATRA改善早期頸動脈粥樣硬化的作用研究.pdf

1、背景：
　　動脈粥樣硬化（arteriosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病發(fā)生與發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，其以血管壁內(nèi)脂質(zhì)蓄積、纖維成分的增加和血管壁慢性炎癥為主要特征。炎癥學(xué)說是AS發(fā)病的決定因素，貫穿了AS的形成和發(fā)展過程。近年的研宄表明，免疫反應(yīng)包括天然免疫和獲得性免疫機制在AS的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的增強可使斑塊表面纖維帽變薄，增加斑塊的不穩(wěn)定性。因此，炎癥反應(yīng)強度是影

2、響動脈粥樣硬化斑塊由結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定向功能性不穩(wěn)定進展的重要因素，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)是維護易損斑塊穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)。全反式維甲酸（all-trans-ratinoic acid，ATRA)是天然維生素A主要衍生物。最近研宄發(fā)現(xiàn)，ATRA具有介導(dǎo)細胞分化、增殖、凋亡及調(diào)節(jié)免疫等作用。他汀類藥物被證明具有調(diào)脂抗炎、改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)粥樣硬化斑塊等作用而在臨床上廣泛應(yīng)用。本研宄擬通過高脂飼料喂養(yǎng)法建立新西蘭白兔頸動脈粥樣硬化模型，同時進行辛伐他

3、汀及ATRA的藥物干預(yù)，進而觀察辛伐他汀及ATRA對頸動脈粥樣硬化中炎癥反應(yīng)的抑制作用，探討ATRA是否通過調(diào)節(jié)TGF-0及其下游通路從而抑制炎癥反應(yīng)，改善并穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的作用，為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　通過高脂飼料喂養(yǎng)法構(gòu)建兔頸動脈粥樣硬化模型，觀察ATRA與辛伐他汀對血脂的影響以及頸動脈粥樣硬化病灶中細胞增殖及炎癥的抑制作用，通過對調(diào)節(jié)性T細胞的炎癥下游分子研宄，探討ATRA基于TGF-0/Sma

4、d通路改善早期頸動脈粥樣硬化的治療作用。
　　方法：
　　1、將34只健康純種雄性新西蘭白兔隨機分為4組：正常對照組（n=6)、模型對照組（n=8)、辛伐他汀治療組（n=10)、ATRA治療組（n=10)。正常對照組給予普通飲食，其余各組給予高脂飼料。實驗4周后辛伐他汀治療組予辛伐他汀2mg/kg·d灌胃給藥，ATRA治療組予ATRA20mg/d灌胃給藥，模型對照組不使用任何藥物，但予以等量生理鹽水灌胃。
　　2、實驗

5、12周末心臟取血，室溫靜置后離心取血清，使用全自動生化分析儀測定血清中總膽固醇（TC)、甘油三酯（TG)、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC)、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDLC)的濃度。并采用酶聯(lián)免疫吸附試劑法（ELISA法）測定血清中TGF-0、IL-6、IL-10、IL-17的水平。
　　3、留取血標(biāo)本后以空氣栓塞法處死動物，取頸動脈組織，石蠟包埋，對頸動脈進行冊染色，觀察斑塊破裂率。
　　4

6、、收集頸動脈組織，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測頸動脈組織中Foxp3、TGF-0、IL-10, MMP-2、MMP-9 mRNA的表達水平。
　　5、所有統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0、Graphpad Prism5統(tǒng)計軟件進行分析。首先對數(shù)據(jù)做正態(tài)性檢驗，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示;兩組間用t檢驗;多組間參數(shù)比較采用單因素方差分析；多組均數(shù)兩兩比較采用檢驗分析；對不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)秩和檢驗；對有相關(guān)

7、趨勢的變量采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、實驗過程順利，正常對照組、模型對照組無死亡，但模型對照組可見有脫毛，皮膚、足趾潰爛等情況。辛伐他汀治療組發(fā)生腹瀉、絕食死亡2只。ATRA治療組因灌胃不當(dāng)所致死亡2只。所得30只動物數(shù)據(jù)參與分析，正常對照組6只，模型對照組8只，辛伐他汀治療組8只，ATRA治療組8只。
　　2、血脂水平變化：高脂飼料喂養(yǎng)能夠形成顯著的高脂血癥，

8、模型對照組較正常對照組TC、LDL-C顯著升高，辛伐他汀能夠有效的降低TC、LDL-C，但ATRA治療組高脂血癥無明顯改善。
　　3、取兔頸動脈行染色結(jié)果顯示，空白對照組兔頸動脈的內(nèi)皮細胞形態(tài)完整，排列整齊，內(nèi)彈力纖維膜清晰完好，動脈中膜平滑肌細胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則，未見明顯斑塊形成；模型對照組兔頸動脈可見典型的動脈粥樣硬化斑塊，內(nèi)有纖維帽及脂質(zhì)核心，以及大量炎癥細胞浸潤，內(nèi)彈力纖維膜斷裂，平滑肌細胞迀移至內(nèi)膜下，動脈中膜可見泡沫

9、細胞及膽固醇結(jié)晶。辛伐他汀治療組及ATRA治療組可見內(nèi)皮細胞形態(tài)尚完整，部分中斷，內(nèi)彈力纖維膜清晰完好，可見部分平滑肌細胞迀移至內(nèi)膜下，動脈中膜平滑肌細胞排列尚整齊，可見部分泡沫細胞形成及少量炎性細胞浸潤。
　　4、ELISA法結(jié)果：與模型對照組相比，辛伐他汀及ATRA治療均明顯提高了血清中抗炎因子TGF-0和IL-10的水平濃度，并降低了促炎因子IL-6、IL-17的水平濃度。
　　5、RT-PCR結(jié)果：實時定量RT-PC

10、R結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組兔頸動脈組織中TGF-01、IL-10、Foxp3 mRNA的含量明顯降低，有顯著性差異（P<0.05)。與模型對照組相比，辛伐他汀治療組和ATRA治療組的抗炎因子TGF-01、IL-10、Foxp3 mRNA的含量明顯升高，有顯著性差異（P<0.05)，但兩者間對比作用差異不明顯（P>0.05)。與正常對照組相比，模型對照組兔頸動脈組織中MMP-2、MMP-9 mRNA的含量明顯升高，有顯著性差

11、異（P<0.05)。與模型對照組相比，辛伐他汀治療組和ATRA治療組的MMP-2、MMP-9 mRNA的含量明顯降低，有顯著性差異(P<0.05)，但兩者間對比作用差異不明顯(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)辛伐他汀能夠有效的改善高膽固醇血癥，而ATRA對血脂水平無明顯影響，其不是通過降低血脂水平來減輕動脈粥樣硬化。
　　(2) ATRA通過TGF-0/Smad通路刺激Foxp3的表達，促進T細胞向調(diào)節(jié)性T細胞