續(xù)斷含藥血清對大鼠胚胎肢芽發(fā)育的影響.pdf

1、目的：研究續(xù)斷含藥血清對SD大鼠胚胎肢芽器官及細(xì)胞的發(fā)育毒性，為保胎類中藥的臨床應(yīng)用提供安全依據(jù)。
　　方法：⑴續(xù)斷水煎液對大鼠急毒實(shí)驗(yàn)及含藥血清制備：選體質(zhì)量180~220g的SD大鼠40只，隨機(jī)分2組（雌雄各半）。采用MTD法：陰性對照組按1ml/100gBW灌胃蒸餾水，藥物組按80g/kgBW灌胃續(xù)斷水煎液，4次/日，灌胃1天。連續(xù)觀察14天；選體質(zhì)量240~300g的SD雄性大鼠30只，隨機(jī)分為5組（6只/組）。第1組為陰

2、性對照組（按1ml/100gBW灌胃蒸餾水）、第2～4組為實(shí)驗(yàn)組（分別按40、20、10g/kgBW劑量灌胃續(xù)斷水煎液）、第5組為陽性對照組（按200mg/kgBW灌胃維A酸），灌胃1次/日，連續(xù)3天，第1組制備正常血清，第2～5組均制備含藥血清。⑵大鼠胚胎肢芽細(xì)胞增殖、分化及凋亡的檢測：選孕15天的大鼠，無菌分離胚胎后肢芽制備成肢芽細(xì)胞懸液，分5組分別接種到96孔（MTT）、24孔（微團(tuán)培養(yǎng)）、24孔（細(xì)胞凋亡檢測）置入CO2培養(yǎng)箱2

3、～3小時，待細(xì)胞貼壁后，將制備好的4組含藥血清和1組正常血清均以培養(yǎng)體積的10％的比例并分別加入各組培養(yǎng)板孔中，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后收獲細(xì)胞：MTT法檢測肢芽細(xì)胞增殖情況；MM法（甲苯胺藍(lán)染色）檢測肢芽細(xì)胞分化情況；Hochest33258染色，檢測肢芽細(xì)胞凋亡情況。⑶大鼠胚胎肢芽器官培養(yǎng)、Tbx2蛋白及mRNA、BMP-2蛋白及mRNA表達(dá)的檢測：選擇E15的大鼠胚胎無菌切取前肢芽，分5組（每組15個肢芽/次，分批次培養(yǎng)）移入60mm無

4、菌培養(yǎng)皿中，將制備好的4組含藥血清和1組正常血清均以10%培養(yǎng)體積，分別加入5組肢芽培養(yǎng)皿中，置入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時，收獲的各組肢芽（50只/組，分批次收集）后即刻處理：每組取20只前肢芽以4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片。每組1/3數(shù)量切片以HE染色，觀察整體肢芽發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化；余2/3切片以免疫組化方法分別檢測Tbx2蛋白與BMP-2蛋白在肢芽中不同位置的表達(dá)情況；每組留30只肢芽置于-80℃即刻凍存。其中20只肢芽提取蛋白

5、質(zhì)，采用Western Blot法檢測整體肢芽中Tbx2和BMP-2蛋白的表達(dá)水平；余10只肢芽提取RNA，以RT-PCR法檢測整體肢芽中Tbx2 mRNA和BMP-2 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①急毒實(shí)驗(yàn)（MTD法），實(shí)驗(yàn)組大鼠根據(jù)續(xù)斷水煎液最大藥物濃度200%、最大灌胃體積1ml/100gBW及灌胃次數(shù)（1日4次），所得最大耐受劑量為80g/kgBW。②續(xù)斷含藥血清對大鼠胚胎肢芽細(xì)胞的影響：實(shí)驗(yàn)各組肢芽細(xì)胞所測OD值的數(shù)

6、據(jù)均高于陰性對照組(0.20±0.014），只有中（0.242±0.024）、低劑量組（0.245±0.045）與陰性對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。而陽性對照組（0.153±0.028）明顯低于陰性對照組，兩組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。提示中、低劑量組續(xù)斷含藥血清能促進(jìn)肢芽細(xì)胞的增殖，而維甲酸則相反，有抑制肢芽細(xì)胞增殖的作用；各實(shí)驗(yàn)組肢芽細(xì)胞的集落面積與中、高劑量組的集落數(shù)均高于陰性對照組，相比均有顯著性差異（P＜

7、0.05）。提示續(xù)斷含藥血清對肢芽細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化有不同程度的促進(jìn)作用。而陽性對照組有抑制作用；陽性對照組凋亡率（0.156±0.058）明顯高于陰性對照組（0.091±0.034），兩組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。各實(shí)驗(yàn)組肢芽細(xì)胞凋亡率雖然均低于陰性對照組，但與之相比無顯著性差異（P﹥0.05），提示續(xù)斷對肢芽細(xì)胞凋亡并無明顯的影響。③續(xù)斷含藥血清對大鼠胚胎肢芽發(fā)育及局部Tbx2、BMP-2蛋白表達(dá)的影響：鏡下可見各實(shí)驗(yàn)組

8、與陰性對照組的肢芽形態(tài)形似，均有軟骨發(fā)育，軟骨內(nèi)細(xì)胞清晰、均勻整齊。肢芽末端指突生長明顯，局部細(xì)胞排列緊密，染色深。指蹼尚未消失。而陽性對照組肢芽軟骨發(fā)育差，肢芽末端未見明顯指突形成，指蹼明顯；Tbx2蛋白與BMP-2蛋白在各實(shí)驗(yàn)組肢芽末端的各指突、肢芽內(nèi)軟骨與間充質(zhì)等部位均有表達(dá)（除BMP-2蛋白在各肢芽末端指突部位表達(dá)與陰性對照組相比無顯著性差異（P﹥0.05）之外），其平均光密度值均高于陰性對照組，與其相比均有顯著性差異（P＜0.

9、05）。提示Tbx2蛋白、BMP-2蛋白的高表達(dá)參與了肢芽發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化過程。而陽性對照組肢芽各部位的Tbx2、BMP-2表達(dá)量均低于陰性對照組，與其相比具有顯著性差異；前肢芽Tbx2和BMP-2的蛋白與mRNA檢測：RT-PCR方法檢測：續(xù)斷含藥血清各實(shí)驗(yàn)組的前肢芽中Tbx2 mRNA和BMP-2mRNA的表達(dá)水平均高于陰性對照組，與其對比均具有顯著性差異（P＜0.05）。而陽性對照組呈低表達(dá)；Western Blot法檢測：續(xù)斷中

10、、高劑量含藥血清組肢芽的Tbx2蛋白與BMP-2蛋白表達(dá)均明顯高于陰性對照組，相比具有顯著性差異（P＜0.05）。陽性對照組低表達(dá)，提示BMP-2與Tbx2低表達(dá)參與其致畸過程。
　　結(jié)論：⑴續(xù)斷水煎液對SD大鼠最大耐受劑量為80g/kg，根據(jù)GB15193-2003中藥急性毒性劑量分級，LD50>21.5g/kg的受試物屬于無毒級。⑵續(xù)斷含藥血清對大鼠胚胎肢芽細(xì)胞增殖和分化有促進(jìn)作用，無細(xì)胞毒性。⑶續(xù)斷含藥血清能促進(jìn)大鼠肢芽器官