人臍血間充質干細胞定向誘導分化為類許旺細胞的生物學特性研究.pdf

1、背景：當今社會周圍神經損傷的發(fā)生率特別高，對于缺損長度超過2cm的損傷目前尚無理想的解決辦法，近些年生物工程學的發(fā)展和干細胞研究深入開展給神經損傷的治療帶來新希望。種子細胞即許旺細胞一直是研究的“瓶頸”，自體及異體的許旺細胞因其自身的缺點未能得到大規(guī)模使用，由干細胞體外誘導而來的類許旺細胞具有廣闊的應用前景，如何證明所誘導的類許旺細胞具有許旺細胞的功能至關重要，許旺細胞具有強大的自分泌和旁分泌功能，這可能是其發(fā)揮生物學效應的機制之一，因

2、此如能證明所誘導的類許旺細胞可以分泌真正許旺細胞分泌的一些功能性蛋白，則可以為后期的進一步研究提供實驗理論依據。
　　目的：分別收集人臍血間充質干細胞、由干細胞誘導分化而來的類許旺細胞以及人引產胎兒來源的許旺細胞的細胞培養(yǎng)上清液，提取其中的蛋白，運用雙向電泳技術比較三種細胞的分泌蛋白差異性及相似性，查詢相關蛋白的主要功能。
　　方法：按照本課題組之前使用的先用羥乙基淀粉沉淀紅細胞，再運用人淋巴細胞分離液離心提取原代間充質干細

3、胞，通過形態(tài)學和流式細胞儀測定細胞表面標志物等方法鑒定和測定其純度，符合要求者進行下一步實驗，取第三代干細胞采用本課題組之前優(yōu)化的誘導方法進行體外人工誘導。采用酶消化法制備人許旺細胞。對三種細胞（間充質干細胞，類許旺細胞，許旺細胞）采用“逐步過度法”過度到無血清培養(yǎng)，收集三種細胞培養(yǎng)上清液，用0.22um濾器過濾去除殘留細胞，加入1mM濃度的蛋白酶抑制劑后放入超低溫冰箱（-80℃）備用。提取培養(yǎng)液里的分泌蛋白，運用雙向電泳和質譜分析技術

4、尋找差異顯著蛋白，對間充質干細胞比許旺細胞少的蛋白和類許旺細胞比間充質干細胞多的蛋白進行匹配，查詢其蛋白的主要功能。
　　結果：
　　1.2-D凝膠電泳圖具有較好的分辨率及重復性，平均每張膠的蛋白表達點有三千左右，匹配率各自是96％、97%、98%。
　　2.誘導前的HUCBMSCs與SCs有397個蛋白差異點，誘導后的類SCs與SCs僅有280個差異蛋白點，說明間充質干細胞誘導為類許旺細胞后在分泌蛋白組學方面更相似于

5、許旺細胞。
　　3.對于按照篩選標準篩選出的12個差異蛋白進行質譜鑒定，最終鑒定出7個蛋白。（剩下五個因蛋白濃度較低無法成功鑒定出來）
　　4.鑒定出的上述分泌蛋白經查文獻得知大部分對神經損傷的修復具有一定的促進作用。
　　結論：
　　1.使用羥乙基淀粉和人淋巴細胞分離液可提取原代的間充質干細胞。
　　2.人臍血間充質干細胞誘導后在分泌蛋白方面更接近真正的許旺細胞。
　　3.本實驗成功鑒定出間充質干細