基于組學(xué)技術(shù)解析葡萄內(nèi)生菌的白藜蘆醇生物合成途徑.pdf

1、白藜蘆醇是一種具有多種功能活性天然化合物，是FDA批準(zhǔn)的膳食營(yíng)養(yǎng)劑，在醫(yī)藥、食品等行業(yè)需求量大，發(fā)展微生物發(fā)酵法合成白藜蘆醇勢(shì)在必行。現(xiàn)有白藜蘆醇合成途徑僅見于植物，揭示微生物中白藜蘆醇合成途徑具有重要的科學(xué)意義。本研究在分離得到自主代謝合成白藜蘆醇的鏈格孢霉MG1的基礎(chǔ)上，基于GC-MS平臺(tái)和HiSeq2500平臺(tái)分別完成該菌的代謝譜測(cè)定及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，綜合分析代謝組和轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)結(jié)果，從物質(zhì)流向和基因水平上揭示了該菌合成白藜蘆醇的代謝途

2、徑，為揭示微生物中白藜蘆醇合成途徑提供理論基礎(chǔ)和事實(shí)依據(jù)，為該菌合成白藜蘆醇的代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。論文的研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:
　　(1)鏈格孢屬M(fèi)G1合成白藜蘆醇的酶學(xué)基礎(chǔ)
　　鏈格孢屬M(fèi)G1含有能夠從葡萄糖合成白藜蘆醇的完整酶系。以從鏈格孢霉MG1中提取的粗酶液為材料，檢測(cè)了該酶液催化葡萄糖合成白藜蘆醇的能力;并通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定了轉(zhuǎn)化體系的最適宜反應(yīng)時(shí)間為120 min，添加適當(dāng)濃度的丙二酰輔酶A、對(duì)香豆酸、輔酶A和AT

3、P能夠有效增加白藜蘆醇產(chǎn)量，證明這些物質(zhì)是該菌合成白藜蘆醇途徑中的必要物質(zhì)。通過(guò)響應(yīng)面分析，確定了轉(zhuǎn)化體系的最優(yōu)條件，使白藜蘆醇產(chǎn)量提高近7倍。將該酶系進(jìn)行海藻酸鈉固定化處理后，可重復(fù)使用5次。
　　(2)鏈格孢屬M(fèi)G1合成白藜蘆醇的代謝流分析
　　鏈格孢屬M(fèi)G1代謝譜的PCA和PLS-DA分析表明:生長(zhǎng)細(xì)胞、靜息細(xì)胞和靜息培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物存在明顯差異;參考KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，這些物質(zhì)中含有白藜蘆醇、白皮杉醇、苯丙酮酸、莽草酸

4、酯、苯丙氨酸、酪氨酸、對(duì)香豆酸等26個(gè)白藜蘆醇合成途徑相關(guān)產(chǎn)物。通過(guò)代謝物質(zhì)與實(shí)驗(yàn)所得物質(zhì)流向，確定出該菌以葡萄糖為底物合成白藜蘆醇的代謝流為:葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑由6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，再經(jīng)苯丙氨酸、酪氨酸生物合成途徑轉(zhuǎn)化為苯丙氨酸和酪氨酸，最后通過(guò)苯丙烷途徑合成白藜蘆醇。
　　(3)鏈格孢屬M(fèi)G1合成白藜蘆醇的轉(zhuǎn)錄組分析
　　使用Hiseq2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)鏈格孢屬M(fèi)G1合成白藜蘆醇時(shí)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)定，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量

5、控制，得到4.64 Gb Clean Data。使用轉(zhuǎn)錄本組裝軟件（Trinity）對(duì)轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行組裝，共得到37163條Transcript和18570條Unigene，Transcript與Unigene的N50分別為5004和2153，組裝完整性較高。
　　通過(guò)與Nr、Nt、Swiss-Prot、COG、GO以及KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)轉(zhuǎn)錄組中相關(guān)基因進(jìn)行功能注釋，成功注釋到14186條Unigene;通過(guò)代謝途徑注釋，將

6、2701條Unigene定位到115個(gè)具體的代謝途徑，其中有84條Unigene涉及或參與白藜蘆醇合成的代謝途徑，包括糖酵解途徑、苯丙氨酸生物合成途徑、苯丙烷途徑及芪類化合物生物合成途徑。其中20條Unigene可以編碼芪類化合物生物合成途徑的4個(gè)關(guān)鍵酶，包括苯丙氨酸解氨酶、對(duì)香豆酰輔酶A連接酶、肉桂酸-4-單氧酶和查爾酮合酶。
　　(4)鏈格孢屬M(fèi)G1合成白藜蘆醇時(shí)的關(guān)鍵基因表達(dá)量分析
　　綜合軟件評(píng)估結(jié)果，確定用于鏈格孢

7、屬M(fèi)G1基因表達(dá)分析的候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序?yàn)門UBA＞ EF1＞ EF2＞ACTB＞RPS5＞ RPS24＞ UBC＞ UFD＞18S;根據(jù)geNorm軟件評(píng)估結(jié)果，確定可用于后續(xù)分析的最優(yōu)內(nèi)參基因組合為TUBA和EF1。不同條件下的基因表達(dá)結(jié)果表明:鏈格孢屬M(fèi)G1的糖酵解途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)量隨菌體生長(zhǎng)時(shí)間的變化而有所不同，但靜息細(xì)胞中各關(guān)鍵酶的表達(dá)水平則均有不同程度增加;生長(zhǎng)細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期(4d)，苯丙氨酸生物合成途徑關(guān)鍵酶的

8、表達(dá)水平普遍較高。生長(zhǎng)細(xì)胞經(jīng)靜息培養(yǎng)后，各關(guān)鍵酶的表達(dá)水平普遍增加，其中以4CL的增加幅度最大，約為360倍;PAL和CHS的表達(dá)量增加了7.6倍和10.2倍;但CYP73A表達(dá)量偏低。這些結(jié)果與鏈格孢屬M(fèi)G1在靜息細(xì)胞體系中能夠快速合成白藜蘆醇的結(jié)果相符，同時(shí)說(shuō)明，這些酶是鏈格孢屬M(fèi)G1合成白藜蘆醇的關(guān)鍵酶，而且CYP73A是合成途徑中的限速酶。
　　總體而言，本研究從酶類活性、物質(zhì)流向和基因表達(dá)等不同水平上確定了鏈格孢屬M(fèi)G1