漢灘病毒嵌合VLP的生物學(xué)活性鑒定及其長效免疫效果研究.pdf

1、【研究背景】
　　漢灘病毒（ Hantaan virus, HTNV）感染在我國主要引起腎綜合征出血熱（Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS），該病缺乏特異有效的治療藥物，通過疫苗接種預(yù)防HTNV感染成為控制疾病發(fā)生的主要手段。病毒樣顆粒（Virus like particle, VLP）是病毒生活周期中結(jié)構(gòu)蛋白自我組裝形成的不含病毒核酸的顆粒樣物質(zhì)，包括 HTNV在內(nèi)的部分病毒，

2、能夠通過基因工程方法表達病毒結(jié)構(gòu)蛋白合成VLP，VLP作為疫苗具有安全性高、免疫效果好的優(yōu)點。在VLP表面嵌合粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）或CD40配體（CD40 ligand, CD40L）的免疫佐劑可提高其免疫效果。本實驗室前期在哺乳動物細胞中成功表達了含有HTNV核衣殼蛋白（Nucleoprotein, NP）和包膜糖

3、蛋白（Glycoprotein, GP）的 HTNV VLP，并在此基礎(chǔ)上嵌合佐劑基因表達出 HTNV VLP-GM-CSF和HTNV VLP-CD40L。本研究旨在明確HTNV嵌合VLPs的生物學(xué)活性，并對其分別免疫小鼠后的長效免疫效果進行初步探討，為HTNV VLP疫苗的應(yīng)用提供一定的實驗基礎(chǔ)。
　　【研究方法】
　　三種HTNV VLPs（后文分別用VLP代表單純HTNV VLP，VLP-GM-CSF代表嵌合GM-CS

4、F的HTNV VLP，VLP-CD40L代表嵌合CD40L的HTNV VLP）分別與無菌分離的 C57BL/6小鼠骨髓細胞共培養(yǎng)，設(shè)置空白對照組，流式細胞術(shù)（Flow cytometry, FCM）檢測骨髓細胞中F4/80+CD11b+細胞、CD11c+細胞的數(shù)量以及MHC-Ⅱ、CD40、CD86分子的表達情況，以評價HTNV VLPs促進骨髓細胞向抗原提呈細胞（Antigen presenting cell, APC）分化、成熟情況。

5、經(jīng)三種HTNV VLPs分別刺激的體外脾臟淋巴細胞中，以及經(jīng)其分別免疫小鼠后分離的脾臟淋巴細胞中，分別檢測CD4+CD25+細胞和 CD8+ CD25+細胞的數(shù)量以測定 T細胞增殖和活化情況，檢測B220+CD69+細胞數(shù)量以測定B細胞增殖和活化情況。
　　三種HTNV VLPs以及HTNV滅活疫苗分別免疫C57BL/6小鼠，設(shè)置生理鹽水對照組，初次免疫6個月后，以相同劑量加強免疫一次，檢測各實驗組加強免疫前、后的體液免疫和細胞免

6、疫效果，初步評價HTNV VLPs的長效免疫效果。間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunoabsordent assay, ELISA）檢測抗HTNV特異性抗體水平，微量細胞中和實驗檢測抗HTNV中和抗體水平來評價各實驗組的長效體液免疫效果；酶聯(lián)免疫斑點實驗（Enzyme-linked Immunospot assay, ELISPOT）測定細胞因子IFN-γ和IL-4分泌水平，細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxi

7、c T lymphocyte，CTL）殺傷實驗評價其長效細胞免疫效果；加強免疫前、后，分別用HTNV攻擊免疫小鼠，通過雙抗體夾心 ELISA法檢測病毒抗原、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)檢測病毒核酸、病理切片觀察實驗小鼠臟器病理變化來評價其長效免疫后的動物保護作用。
　　【實驗結(jié)果】
　　FCM檢測結(jié)果顯示，三種HTN

8、V VLPs分別刺激的小鼠骨髓細胞F4/80+CD11b+細胞、CD11c+細胞數(shù)量以及MHC-Ⅱ、CD40和CD86分子表達水平均明顯升高，表明其有效地刺激了小鼠骨髓細胞向APC分化、成熟。三種HTNV VLPs體外分別刺激的小鼠脾臟淋巴細胞和經(jīng)其免疫后小鼠的脾臟淋巴細胞中 CD4+ CD25+、CD8+CD25+T細胞數(shù)量和B220+CD69+B細胞數(shù)量均明顯增高，表明HTNV VLPs均有效地促進小鼠體內(nèi)及體外 T、B淋巴細胞增殖

9、和活化。其中，VLP-GM-CSF在促進骨髓細胞向APC分化成熟方面和促進小鼠體內(nèi)、外T細胞增殖和活化方面作用更為明顯。而在促進小鼠體內(nèi)、外B淋巴細胞增殖和活化方面，VLP-CD40L的作用更為明顯。
　　長效體液免疫結(jié)果顯示，HTNV滅活疫苗組小鼠血清中幾乎未檢測到抗 HTNV NP特異性抗體，且僅檢測到少量的中和抗體。HTNV VLPs分別免疫的小鼠血清中抗HTNV NP特異性抗體和中和抗體水平均高于HTNV滅活疫苗組，VLP

10、-GM-CSF和VLP-CD40L組小鼠抗HTNV NP特異性抗體與中和抗體水平高于VLP免疫組小鼠。加強免疫后，小鼠抗HTNV NP特異性抗體與中和抗體水平均比加強免疫前有所提高。長效細胞免疫結(jié)果顯示，HTNV滅活疫苗組和生理鹽水對照組相比，IFN-γ分泌水平相當(dāng)，而三種HTNV VLPs分別免疫小鼠后，脾細胞IFN-γ分泌水平明顯高于HTNV滅活疫苗組。加強免疫后，各實驗組小鼠脾細胞 IFN-γ分泌水平均高于加強免疫前的水平，而且V

11、LP-GM-CSF和VLP-CD40L免疫組小鼠脾細胞IFN-γ分泌水平明顯高于VLP免疫組。但各實驗組小鼠脾細胞IL-4分泌水平均與生理鹽水對照組分泌水平相當(dāng)。各實驗組小鼠CTL殺傷結(jié)果差異和脾細胞分泌的IFN-γ變化相一致。
　　免疫6個月后，對各實驗組小鼠進行HTNV攻擊。結(jié)果顯示，HTNV滅活疫苗組與生理鹽水對照組小鼠部分臟器內(nèi)檢測到較高水平的病毒抗原和核酸，病理切片觀察小鼠肝臟、腎臟和肺臟出現(xiàn)炎細胞浸潤等病理改變。經(jīng)HT

12、NV VLPs分別免疫的小鼠組織器官中病毒抗原和核酸含量均明顯低于生理鹽水對照組，且未見明顯的病理改變。表明HTNV VLPs分別免疫的小鼠均有效抵抗了病毒攻擊，而HTNV滅活疫苗免疫組小鼠不具有抵抗病毒攻擊的能力。加強免疫后，HTNV滅活疫苗免疫組和HTNV VLPs免疫組小鼠臟器中HTNV抗原和核酸載量均較生理鹽水對照組明顯降低，且臟器未見明顯病理改變，表明加強免疫后各實驗組均具有良好的動物保護作用。
　　【結(jié)論】
　　

13、本課題分別對前期構(gòu)建的三種 HTNV VLPs生物學(xué)活性及長效免疫效果進行了研究，發(fā)現(xiàn)HTNV VLPs分別在小鼠體內(nèi)、外的實驗中發(fā)揮良好的生物學(xué)活性。在對其長效免疫研究中發(fā)現(xiàn)，HTNV滅活疫苗免疫效果差，且?guī)缀鯖]有動物保護作用，需進行加強免疫后才具有一定的免疫效果和動物保護作用。HTNV VLPs分別具有長效免疫效果，而且VLP-GM-CSF和VLP-CD40L與VLP相比表現(xiàn)出更好的免疫效果，加強免疫可以增強HTNV VLPs的免疫