創(chuàng)傷后膿毒癥遺傳易感性的流行病學(xué)和臨床關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、背景：目前，創(chuàng)傷是世界范圍內(nèi)的一個較為嚴(yán)重的公共健康問題，也是青年人致死的主要原因。隨著治療手段和護(hù)理技術(shù)的不斷發(fā)展，嚴(yán)重創(chuàng)傷病人也逐漸能夠在創(chuàng)傷中生存下來。然而創(chuàng)傷后并發(fā)癥仍然是住院病人致死的主要原因。因此，在第一時間預(yù)測并阻止創(chuàng)傷并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展將會是治療創(chuàng)傷的一項有效措施。眾所周知，膿毒癥以及多器官功能障礙綜合征(MODS)是較為常見且嚴(yán)重的創(chuàng)傷并發(fā)癥。當(dāng)機(jī)體遇到微生物侵襲后所發(fā)生的超過機(jī)體承受能力的炎癥反應(yīng)是膿毒癥發(fā)生的根本原

2、因。眾多炎癥因子的產(chǎn)生和釋放也將會促進(jìn)血管內(nèi)凝血和多器官功能障礙的發(fā)生。這種過度的炎癥反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制或許能為我們探索膿毒癥以及多器官功能障礙的相關(guān)危險因素提供有價值的線索。
　　白介素6（interleukin-6，IL-6）是一種由內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它能夠刺激B、T等淋巴細(xì)胞，而且可以誘導(dǎo)發(fā)熱。目前的一些研究證實IL-6在細(xì)菌入侵機(jī)體時所發(fā)生的炎癥反應(yīng)中扮演者重要的角色。Toll樣受體2(Toll

3、-likeReceptor2，TLR2)是TLR家族中的一員，它能夠識別一系列的細(xì)菌脂蛋白分子。有研究認(rèn)為TLR2蛋白分子是抵抗感染的最原始屏障中的一員。截止目前，越來越多的學(xué)者試圖探索IL-6和TLR2兩個基因上的單核苷酸多態(tài)性與膿毒癥發(fā)生風(fēng)險的臨床關(guān)聯(lián)性。在這些常見的SNP位點(diǎn)中，IL-6-174G/C和TLR2 Arg753Gln兩個多態(tài)性位點(diǎn)被廣泛研究。然而，目前的結(jié)果卻存在較大的爭議。因此，我們在論文的第一部分通過meta分析

4、進(jìn)一步探索IL-6-174G/C和TLR2 Arg753Gln兩個位點(diǎn)的多態(tài)性對膿毒癥發(fā)生和發(fā)展的影響。
　　過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome Proliferator-Activated Receptors，PPARs）是一類核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子。它們在調(diào)節(jié)代謝、細(xì)胞的增殖和分化以及免疫反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要的作用。目前為止，在人類中共發(fā)現(xiàn)了PPAR家族的三種亞型，即PPARα、PPARβ/δ以及PPARγ。除

5、了關(guān)于PPAR家族成員在代謝方面重要作用的報道之外，人們開始越來越多地探索該家族成員在炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展中的作用。這其中包括炎性腸病、腫瘤和蛋白尿性腎病等較為常見的炎性疾病。目前的研究顯示這類受體能夠?qū)F-κB的下游的炎性目的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，這或許是該家族成員發(fā)揮抗炎作用的一種較為常見的機(jī)制。而且PPAR家族成員的配體能夠?qū)ρ装Y反應(yīng)發(fā)生部位的白細(xì)胞聚集過程產(chǎn)生抑制作用。因此，探索PPAR家族成員在膿毒癥和多器官功能障礙發(fā)生發(fā)展中的

6、潛在作用或許對我們進(jìn)一步明確該疾病的病理生理以及治療起到重要的作用。近期，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)對創(chuàng)傷后不同患者的炎癥反應(yīng)差異有著重要的作用。雖然現(xiàn)階段不少學(xué)者已經(jīng)對PPAR家族基因在炎性疾病中的作用展開一定的研究，但是針對該家族成員的等位基因突變對創(chuàng)傷后膿毒癥以及MODS的影響卻少有探究?；谝陨闲畔?，我們在論文的第二部分通過在PPAR家族成員的全基因范圍內(nèi)挑選SNP位點(diǎn)，繼而探索其對創(chuàng)傷后膿毒癥和多器官功能障礙的

7、影響。
　　材料和方法：
　　1.meta分析
　　我們首先通過PubMed，Embase和Web of Knowledge三個數(shù)據(jù)庫對已發(fā)表文獻(xiàn)進(jìn)行檢索。兩位實驗人員按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立對檢索的文獻(xiàn)展開篩查，并完成對相關(guān)數(shù)據(jù)的提取工作。由于目前人們對膿毒癥的遺傳模型還不確定，所以我們采用等位基因模型(Bvs.A)、共顯性模型(BB vs.AA)、隱性模型(BB vs.AB+AA)以及顯性模型(BB+ABvs.AA)分別

8、進(jìn)行meta分析。我們用比值比和95％置信區(qū)間來評價相應(yīng)的SNP位點(diǎn)和膿毒癥發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)性。Z檢驗用于評價合并后的比值比。除此之外，我們又分別進(jìn)行了亞組分析、異質(zhì)性分析、敏感性分析以及發(fā)表偏倚的檢測來進(jìn)一步評價相關(guān)SNP位點(diǎn)與膿毒癥的風(fēng)險。
　　2.PPAR家族基因多態(tài)性與創(chuàng)傷后膿毒癥發(fā)生風(fēng)險的臨床關(guān)聯(lián)性研究
　　我們研究中共納入734例中國創(chuàng)傷病人，所有患者均為生活在重慶的漢族人?；虻难芯繀^(qū)域包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游延伸3

9、kb區(qū)域、終止密碼下游延伸3kb以及基因的所有外顯子和內(nèi)含子。通過登錄HapMap數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)站，我們獲得上述研究區(qū)域內(nèi)的所有SNP位點(diǎn)信息。利用Haploview軟件對PPARα、PPARβ和PPARγ基因研究區(qū)域內(nèi)的所有SNP位點(diǎn)分別構(gòu)建單倍型。共計挑選出9個標(biāo)簽SNP位點(diǎn)。我們使用改進(jìn)的多重高溫連接酶檢測反應(yīng)(iMLDR)技術(shù)對所收集的樣本DNA展開基因分型工作。另外，我們采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)的方法對經(jīng)過LPS刺激后的外周血白細(xì)胞的腫瘤

10、壞死因子α表達(dá)水平進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：
　　1.meta分析
　　我們的結(jié)果顯示共有20個研究和7個研究分別探索了IL-6-174G/C位點(diǎn)的基因多態(tài)性與膿毒癥的發(fā)生和死亡的相關(guān)性。Meta分析顯示目前在四種遺傳模型下，并沒有直接的證據(jù)證明IL-6-174G/C位點(diǎn)的突變與膿毒癥的發(fā)生和死亡存在明顯的相關(guān)性。同樣的，亞組分析結(jié)果也顯示二者之間沒有必然的相關(guān)性存在。雖然我們在隱性模型下發(fā)現(xiàn)IL-6-174G/C位點(diǎn)的突

11、變與膿毒癥的死亡率有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性，但是經(jīng)過Bonferroni校正后這種關(guān)聯(lián)性消失。
　　在TLR2 Arg753 Gln位點(diǎn)的基因多態(tài)性和膿毒癥的發(fā)生風(fēng)險的meta分析中我們共納入了12項研究，包含898名膿毒癥病人和1517名對照。結(jié)果顯示在等位基因模型和顯性模型下，TLR2 Arg753Gln位點(diǎn)的多態(tài)性和膿毒癥的發(fā)生風(fēng)險存在明顯的關(guān)聯(lián)。另外，亞組分析與總的分析結(jié)果一致，TLR2 Arg753Gln位點(diǎn)的多態(tài)性能夠影響膿毒癥

12、的發(fā)生。
　　2.PPAR家族基因多態(tài)性與創(chuàng)傷后膿毒癥發(fā)生風(fēng)險的臨床關(guān)聯(lián)性研究
　　研究中的734名病人均存活48小時以上。隨訪發(fā)現(xiàn)共有300人發(fā)生膿毒癥，其中138人(46％)出現(xiàn)病原菌血培養(yǎng)陽性。374人(51％)發(fā)生器官功能障礙，其中116人發(fā)生兩個或兩個以上器官功能障礙。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)呼吸道感染是最常見的感染類型。在所有PPAR家族的SNP位點(diǎn)中我們篩選出9個標(biāo)簽SNP位點(diǎn)，分別為rs135551、rs5769178、rs

13、4253711、rs4823613、rs6902123、rs2016520、rs4684846、rs10865710和rs1822825。除rs2016520位點(diǎn)位于5'UTR位置和rs10865710位點(diǎn)位于Exon A2位置以外，其余位點(diǎn)均位于內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)。在我們的研究人群中，這9個標(biāo)簽SNP位點(diǎn)的最小等位基因頻率(MAF)分別為7.6％(rs135551)、15％(rs5769178)、14.4％(rs4253711)、23.2％

14、(rs4823613)、3.1％(rs6902123)、30.4％(rs2016520)、45.8％(rs4684846)、34.6％(rs10865710)和45.5％(rs1822825)。所有位點(diǎn)的基因型在研究人群中的分布均滿足哈代-溫伯格平衡。進(jìn)一步統(tǒng)計分析顯示，我們所研究的每一個SNP位點(diǎn)的不同基因型的人群在性別、年齡和ISS評分上都沒有明顯的差異。PPARγ基因rs10865710位點(diǎn)攜帶G等位基因的病人與攜帶C等位基因的病

15、人相比會明顯提高膿毒癥的發(fā)生率和MODS評分（隱性模型下該位點(diǎn)突變與膿毒癥發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)性P=0.002，與多器官功能障礙評分的相關(guān)性P=0.041;顯性模型下位點(diǎn)突變與膿毒癥發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)性P=0.046）。對該位點(diǎn)在等位基因模型下進(jìn)行回歸分析時我們發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與膿毒癥的發(fā)生風(fēng)險仍有明顯的相關(guān)性(P=0.001)。而其他八個位點(diǎn)在我們的研究中并未發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS評分具有明顯的相關(guān)性。進(jìn)一步分析顯示，在60例創(chuàng)傷病人的標(biāo)本（r

16、s10865710位點(diǎn)基因型為GG、GC和CC的樣本各20例）中，rs10865710位點(diǎn)的突變與LPS誘導(dǎo)外周白細(xì)胞后腫瘤壞死因子α的表達(dá)水平有明顯的相關(guān)性。攜帶G等位基因的病人腫瘤壞死因子α的表達(dá)水平明顯高于攜帶C等位基因的病人(顯性模型下P=0.041，隱性模型下P=0.027)。
　　結(jié)論：本文第一部分結(jié)果顯示TLR2 Arg753G1n位點(diǎn)的多態(tài)性可以顯著影響膿毒癥的發(fā)生風(fēng)險。因此，該位點(diǎn)或許能夠用于膿毒癥發(fā)生風(fēng)險的預(yù)警

17、診斷。然而，meta分析結(jié)果表明IL-6-174G/C位點(diǎn)的多態(tài)性對膿毒癥的發(fā)生率和死亡率并沒有明顯影響。我們需要大樣本的研究來進(jìn)一步證實我們的結(jié)論。
　　第二部分中，我們在PPAR家族三個成員基因的研究區(qū)域內(nèi)共挑選出9個SNP位點(diǎn)。結(jié)果顯示在中國漢族人中PPARγ基因rs10865710位點(diǎn)的突變與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS的風(fēng)險具有明顯的相關(guān)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變與LPS誘導(dǎo)的外周白細(xì)胞的腫瘤壞死因子α的表達(dá)水平有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)