人子宮內(nèi)膜腺癌來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離鑒定及生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：分離培養(yǎng)并鑒定子宮內(nèi)膜腺癌組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞（ Endometrial adenocarcinoma derived Mesenchymal Stem Cells，ECMSCs），比較其與正常子宮內(nèi)膜組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（ Endometrium derived Mesenchymal Stem Cells， EMSCs）的生物學(xué)特性差異，為研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制、侵襲轉(zhuǎn)移及對腫瘤微環(huán)境的影響提供理論與實驗依據(jù)。
　　

2、方法：1.無菌條件下獲取子宮內(nèi)膜腺癌組織,經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化后種植于培養(yǎng)瓶中，用含有10％ FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用組織貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺癌組織來源 MSCs，0.25%胰酶消化傳代，同時取正常子宮內(nèi)膜組織來源 MSCs做對照培養(yǎng)。顯微觀察子宮內(nèi)膜腺癌和正常子宮內(nèi)膜組織來源 MSCs細(xì)胞形態(tài)，瑞氏-姬姆薩染色觀察細(xì)胞核質(zhì)，CCK8法檢測細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型及細(xì)胞周期。誘導(dǎo)MSCs向脂肪、成骨細(xì)胞分化，通過油

3、紅O染色檢測成脂誘導(dǎo)分化能力，堿性磷酸酶染色及Von Kossa染色檢測成骨誘導(dǎo)分化能力，并提取總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測相關(guān)成脂成骨轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量變化。2.對分離鑒定得到子宮內(nèi)膜腺癌及正常子宮內(nèi)膜組織來源 MSCs進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)能力的檢測，通過淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗（Lymphocyte transformation test，LTT)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實驗（Mixed Lymphocyte Reaction，MLR)檢測MSCs抑

4、制T細(xì)胞增殖的免疫調(diào)節(jié)能力。并通過RT-PCR技術(shù)檢測兩種MSCs的免疫相關(guān)因子IL-6、IL-10、VEGF和TGF-β1的表達(dá)差異性。
　　結(jié)果：1.從子宮內(nèi)膜腺癌組織中可培養(yǎng)出貼壁生長的成纖維樣的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈長梭狀，旋渦狀和放射狀排布，原代生長緩慢，經(jīng)α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代后生長迅速，凍存復(fù)蘇后仍保持較強(qiáng)的增殖能力；經(jīng) CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況，繪制子宮內(nèi)膜腺癌來源MSCs的細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞呈“S”型曲線生長；流式

5、細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，可見80%左右細(xì)胞分布在G0/G1期，檢測相關(guān)細(xì)胞標(biāo)記物，細(xì)胞表達(dá)CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-ABC，不表達(dá)CD14、CD34、CD45、CD31、HLA-DR，提示分離得到的細(xì)胞符合MSCs的干細(xì)胞特征；此分離得到的細(xì)胞可經(jīng)誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞，油紅 O染色可見有大量脂滴出現(xiàn)，RT-PCR檢測可見脂肪分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ2的顯著表達(dá)；經(jīng)成骨誘導(dǎo)14天，可見堿性磷酸酶染色陽性，誘導(dǎo)28天Vo

6、n-Kossa染色可見鈣化骨結(jié)節(jié)形成；RT-PCR檢測可見成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Osteocalcin的表達(dá)，說明從子宮內(nèi)膜腺癌組織中成功分離得到MSCs。2.對從子宮內(nèi)膜腺癌組織中分離得到的 MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行檢測。LTT結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs能有效抑制經(jīng)由ConA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖，且隨著MSCs數(shù)量的增加，其抑制能力逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)；與之相近， MLR結(jié)果證實MSCs也可抑制異體淋巴細(xì)胞作為抗原刺激T細(xì)

7、胞增殖的過程，且伴隨MSCs用量增加，其抑制作用更顯著。通過RT-PCR檢測MSCs中各免疫因子表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs中IL-10、VEGF、TGF-β1的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），IL-6差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：1.從子宮內(nèi)膜腺癌組織中分離培養(yǎng)出MSCs，子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs和正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs形態(tài)主要以長梭形為主，

8、呈旋渦狀生長排布。2.子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs表達(dá)CD73、CD90、CDCD105、CD166、HLA-ABC，不表達(dá)CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR，細(xì)胞周期及細(xì)胞表面標(biāo)記物符合干細(xì)胞特征。3.子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs具有分化成脂肪及成骨細(xì)胞的能力，其成脂分化能力強(qiáng)于正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。4.體外LTT和MLR實驗結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs及正常子宮內(nèi)膜