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文檔簡介
1、目的:血吸蟲病是一種呈全球分布的、危害嚴重的人獸共患寄生蟲病。流行于中國的主要為日本血吸蟲病,在我國其仍然是一個值得重視的嚴重的公共衛(wèi)生問題。我國現(xiàn)有的吡喹酮化療、滅螺等血防措施雖然對血吸蟲病的防治起到重要作用,但尚不能達到完全控制甚至消除血吸蟲病的目的,而血吸蟲病疫苗的研究為此帶來了希望。由于各種不足,目前為止尚沒有一種安全、有效的血吸蟲疫苗應(yīng)用于臨床。本研究擬利用日本血吸蟲(Schistosoma japonicum,Sj)14-3
2、-3和Sj32抗原編碼基因,以兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)為“載體”,構(gòu)建日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗,并研究Sj14-3-3-Sj32融合基因在兩歧雙歧桿菌中的表達情況,為日本血吸蟲病疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
方法:
1.以本室保存的質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3和pET28α-Sj32為模板,通過PCR擴增出Sj14-3-3和Sj32抗原編碼基
3、因,再將得到的兩個目的基
因用基因拼接技術(shù)(gene SOEing)進行剪接,得到Sj14-3-3-Sj32融合基因;再將穿梭表達載體pGEX-1λT與構(gòu)建的融合基因拼接,得到重組質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32;采用電穿孔法將pGEX-Sj14-3-3-Sj32轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)中,再用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)對其進行誘導(dǎo)表達;最后采用
4、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE)鑒定表達產(chǎn)物,用蛋白印跡(Western blot)技術(shù)對表達蛋白的免疫原性進行分析。
2.培養(yǎng)Bb菌,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32電轉(zhuǎn)化至B b菌中,構(gòu)建重組Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗;用IPTG對疫苗進行誘導(dǎo)表達,再通過SDS-PAGE鑒定表達產(chǎn)物,以及Western blot技術(shù)分析表達蛋白的免疫原性。
結(jié)果:
5、
1.采用基因拼接技術(shù)成功得到長度約為1750 bp的Sj14-3-3-Sj32融合基因;重組質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32經(jīng)雙酶切證實構(gòu)建成功;SDS-PAGE分析結(jié)果顯示重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達的產(chǎn)物為Mr約73kDa的重組蛋白;Western blot顯示表達的重組蛋白可被Sj感染的兔血清所識別。
2.雙酶切和PCR均證實重組質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32成功轉(zhuǎn)入Bb菌中,rBb(pGEX
6、-Sj14-3-3-Sj32)疫苗構(gòu)建成功;SDS-PAGE分析顯示,重組質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可在Bb菌中表達Mr約73KDa的重組蛋白,與預(yù)期結(jié)果相符,且在誘導(dǎo)后的2~3d表達水平較高,表達的蛋白占菌體總蛋白的8.2%;Western blot結(jié)果顯示Sj感染的兔血清可識別所表達的重組蛋白。
結(jié)論:
1.成功合成融合基因Sj14-3-3-Sj32,并與穿梭表達載體連接后得到重組質(zhì)
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