F-,0-F-,1--ATP合酶的純化和應(yīng)用研究.pdf

1、ATP合酶(F0F1-ATPase)廣泛分布于生物體內(nèi)，是能量代謝的關(guān)鍵酶。它是一個(gè)多亞基復(fù)合體，按照極性ATP合酶(F0F1-ATPase)可分為在膜外親水部分和結(jié)合于細(xì)胞膜上的疏水部分，這一特性也使得其純化比較復(fù)雜。本文分別通過(guò)兩種方法對(duì)這一蛋白進(jìn)行純化：一種是通過(guò)突變的方法對(duì)帶有ATP合酶全酶基因的質(zhì)粒進(jìn)行改造，在c亞基上引入組氨酸標(biāo)簽。隨后通過(guò)Ni-NTA柱利用親合層析的方式純化蛋白，以其中帶有His標(biāo)簽的亞基為結(jié)合對(duì)象而純化出

2、整個(gè)酶：另外一種是針對(duì)野生型嗜熱菌(Thermomicrobium roseum)設(shè)計(jì)的方法。先在較高溫度下進(jìn)行篩選并繼續(xù)培養(yǎng)該菌株，收集足夠菌體后進(jìn)行破碎和離心處理，得到中間產(chǎn)物載色體。除滿足隨后試驗(yàn)需要外，還可繼續(xù)利用該中間產(chǎn)物經(jīng)過(guò)離心、離子交換柱等步驟對(duì)其中所含的ATP合酶進(jìn)行純化。 依據(jù)其催化機(jī)理與結(jié)構(gòu)，ATP(F0F1-ATPase)合酶可分為“定子(ab2δα3β3)”和“轉(zhuǎn)子(γεCn)"兩部分。研究表明在其中的

3、β亞基上連接不同負(fù)載時(shí)，可以不同程度影響其ATP合成活性。因此在得到具有生物學(xué)活性的較純F0F1-ATPase酶的基礎(chǔ)上，結(jié)合免疫學(xué)和生物化學(xué)的方法，構(gòu)建的IRB可以通過(guò)“β亞基抗體-生物素-親和素-生物素-CL抗體(TF1βantibody-biotin-streptavidin-biotin-CL antibody)”探測(cè)相特異原。利用ATP合酶在ATP合成過(guò)程中的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)特性檢測(cè)熒光探針信號(hào)變化來(lái)反映，因此極大提高了檢測(cè)靈敏度。