豬鏈球菌高黏附性菌株篩選及其生物學特性.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）根據(jù)其英膜抗原(CPS)組分的不同，被分為35（1～34型，1/2型）種血清型，致病性血清型主要在1～9型，其中血清型2型(SS2)是致病力最強研究最多的豬鏈球菌。豬鏈球菌2型（Streptococcus suistype2，SS2）是引起人畜共患急性、熱性傳染病的致病菌之一，在世界各地均有流行，曾在我國兩次較大規(guī)模爆發(fā)并引起人類感染死亡。近年來的研究主要集中在與致病性相關(guān)的毒力因子

2、，如莢膜多糖(CPS)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素(SLY)、纖連結(jié)合蛋白(FBPS)，血清渾濁因子OFS，89KD毒力島等。目前國內(nèi)預防豬鏈球菌的疫苗有豬鏈球菌2型滅活疫苗和2型與C群二價滅活疫苗。但由于豬鏈球菌致病血清型較多，不同型之間交叉保護性未知或交叉保護性較差，難以有效控制豬鏈球菌病。此外，雖然國內(nèi)有基于MRP和莢膜抗原的豬鏈球菌2型抗體的ELISA檢測試劑盒，但非2型在豬群中的感染可能無法檢測到，因此

3、也無法了解2型以外豬源鏈球菌的感染狀況。
　　本研究旨在:(1)篩選具有高黏附力和低致病性（或非致病性）的非2型豬鏈球菌作為疫苗候選菌株;(2)分析抗SAO和DnaJ蛋白多抗與不同血清型鏈球菌的交叉反應性;(3)建立基于SAO蛋白的間接ELISA體系，檢測試驗豬場健康豬群中豬鏈球菌抗體陽性率，并與已有的SS2檢測試劑盒結(jié)果進行比較。
　　本實驗在295份采集樣品中分離獲得66株非2型豬鏈球菌，通過細菌黏附試驗篩選出8株黏附率

4、顯著高于HA9801強毒株(1.2％)的菌株（5％-27％）。經(jīng)血清型鑒定，SS281菌株為血清4型，HN152菌株為31型，其余6株無法確定血清型。經(jīng)測序分析，8株菌株與HA9801菌株16s rRNA基因序列同源性在97.3％～99.9％之間，進化樹分析其中7株與HA9801菌株分屬同一群。各菌株鏈長、生長特性和主要毒力因子（mrp/ep f/or f2/s ly/gapd h/fbps/ef）分布情況在菌株間存在差異。細胞毒性試驗

5、結(jié)果表明，8菌株細胞毒性均顯著低于HA9801強毒株;小鼠毒力試驗結(jié)果顯示，HN152菌株致死率顯著低于其他菌株（28％，感染劑量1.9×108 cfu/鼠）。
　　DnaK家族中的DnaJ蛋白是SS2重要的表面蛋白，也應該保守存在于其它血清型SS。SAO蛋白也普遍存在于各血清型豬鏈球菌表面，序列分析結(jié)果表明，本試驗涉及的不同SS菌株之間dnaJ和sao基因之間的核苷酸同源性分別在87％-100％和94％-100％。應用實驗室現(xiàn)有

6、的SS2的DnaJ和SAO高免血清，通過全菌ELISA、Dot-ELISA及免疫印跡方法分析不同血清型的交叉反應性。結(jié)果表明，SS2 DnaJ多抗與SS2、SS4、SS5、SS7、SS9、SS31等血清型交叉反應性良好，而SAO多抗則只與SS2反應。用原核表達DnaJ和SAO蛋白作為包被抗原建立了間接ELISA檢測體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DnaJ與SS2全菌多抗及SS感染陽性血清反應性差，無法建立ELISA體系，而SAO蛋白作為包被抗原的間接EL

7、ISA檢測體系成功優(yōu)化。應用該ELISA檢測體系和商品化SS2檢測試劑盒對4個豬場的150份血清進行抗體檢測，結(jié)果表明SAO-ELISA的豬鏈球菌抗體陽性率高達53％，而基于CPS2-ELISA的豬鏈球菌2型抗體陽性率也高達47％。如果商品化試劑盒的結(jié)果可靠，那么這些豬場的SS2血清陽性率很高，可能存在非2型鏈球菌的感染。
　　綜合上述結(jié)果，雖然我們篩選到了黏附率相對較高的菌株，但是因為在108cfu接種水平對小鼠均有不同程度致病