Pim-3表達下調(diào)對肺腺癌A549細胞生物學(xué)行為影響及其分子機制.pdf

1、肺癌居全球腫瘤發(fā)病死亡原因的首位。盡管目前的診斷和治療方案有很大的改善，但是處于不同臨床階段的肺癌病人的5年生存率仍為15％左右，這可能是由于其高轉(zhuǎn)移潛能所致。目前，肺癌具有2種主要類型，即小細胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancers， NSCLC），當(dāng)前肺癌的大多數(shù)病例是NSCLC，其占所有肺癌病例的85%左右。長期抽煙人群是肺癌發(fā)生的

2、主要原因（80-90%），而非吸煙者大約占10-15%，這可能是由于遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。在所有的治療方案中，化療對NSCLC僅有微小的效果，但受劑量相關(guān)的毒性限制。興起的分子靶向治療對改善肺癌病人的生存率方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用，同時新的分子靶點也被鑒定，這為肺癌病人的治療帶來新的希望。最為重要的是，肺腺癌容易在不同的器官中形成遠端的大的轉(zhuǎn)移灶，這為肺腺癌患者的治療帶來新的挑戰(zhàn)。因此開發(fā)新的有效的治療方案和尋找早期肺腺癌的診斷標

3、記仍是全球科研工作者共同關(guān)注的焦點。
　　Pim-3，作為一個新的癌基因，最初是在大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系 PC12細胞中通過膜的去極化或毛喉素誘導(dǎo)而鑒定出來的一個新基因，被命名為去極化誘導(dǎo)的激酶 KID-1。然而，由于 KID-1與前病毒整合位點莫羅尼鼠白血病病毒（Provirus integrating site Moloney murine leukemia virus，Pim）家族蛋白具有高度的序列相似性，因而重新命名為Pim

4、-3。Pim-3主要定位于人類染色體22q13，其開放閱讀框編碼326個氨基酸，分子量為35861。人類Pim-3蛋白分別和Pim-1和Pim-2的氨基酸相似度為57.1%和44.0%，和其它物種Pim激酶的相似度分別為大鼠95.0%，小鼠95.0%，鵪鶉Pim73.9%和非洲爪蟾Pim-168.7%。在不同的人類組織中均發(fā)現(xiàn)有Pim-3 mRNA的表達，包括心臟、腦、肺、腎臟、脾臟、胎盤、骨骼肌和外周血白細胞。然而，在結(jié)腸、胸腺、肝臟

5、和小腸中未見Pim-3 mRNA的表達。最近越來越多的研究表明，Pim-3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可能成為腫瘤治療的潛在分子靶點。許多人類 Ewing家族的腫瘤細胞系中均有Pim-3 mRNA的表達。此外，在鼻咽癌細胞系中也發(fā)現(xiàn)Pim-3 mRNA的過表達。此外，研究表明，Pim-3在正常成人內(nèi)胚層來源的器官中幾乎不表達，如肝臟、胰腺、結(jié)腸和胃，然而，當(dāng)這些器官發(fā)生病變或惡性損傷時，Pim-3的表達增強。Pim-3在這些腫瘤中幾乎均

6、定位于細胞質(zhì)中。在肝臟中，Pim-3蛋白在再生結(jié)節(jié)和腺瘤樣增生以及癌旁組織中有表達，而且檢測表達的頻率顯著高于肝癌細胞。在結(jié)腸和胃癌中也具有相似的研究，如Pim-3蛋白的表達在腺瘤組織中比腺癌組織具有更高的發(fā)生率。這些研究表明，異常的Pim-3的表達可能發(fā)生在腫瘤發(fā)生的早期階段，進而可能成為腫瘤發(fā)生早期的檢測的分子標記。
　　此外，Pim-3在腫瘤中發(fā)揮生物學(xué)機制的作用形式多種多樣。來自胰腺癌和結(jié)腸癌的研究表明，增加Pim-3的表

7、達能增加Ser112位的Bad的磷酸化的總量，而Pim-3 shRNA作用后降低Ser112位的Bad的磷酸化的總量，因而，Pim-3可能抑制這些腫瘤細胞凋亡并最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。研究表明，Pim-3 shRNA能顯著誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡，并降低磷酸化的STAT3（Tyr705）（Signal transducers and activators of transcription3），Bcl-XL和pBad（Ser112）的表達水平，表明P

8、im-3表達下調(diào)通過降低 STAT3的磷酸化水平抑制肝癌細胞的增殖。此外，Pim-3與腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）具有十分重要的關(guān)系，TNF-α能增強Pim-3 mRNA的穩(wěn)定性，而下調(diào)Pim-3的表達阻止TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞的形成，這些結(jié)果表明Pim-3在TNF-α誘導(dǎo)的血管生成中發(fā)揮重要的作用。這些機制的研究充分顯示Pim-3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性，因而可能成為腫瘤治療的新的分子靶

9、點。
　　然而，迄今為止，關(guān)于Pim-3在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展及進展中的分子機制尚不清楚，因此，在本研究中，我們利用免疫組織化學(xué)方法檢測肺腺癌組織和正常組織中 Pim-3蛋白的表達，分析其表達與肺腺癌病人臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，并采用Western blotting進一步驗證肺腺癌組織和正常組織中Pim-3蛋白的表達，初步闡明其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。進一步我們通過 siRNA介導(dǎo)肺腺癌A549細胞中Pim-3表達下調(diào)，分析其對其

10、表達下調(diào)對肺腺癌細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響，并檢測STAT3信號途徑的活化狀態(tài)，分析該信號途徑中下游靶基因表達的變化，初步揭示Pim-3在肺癌發(fā)生發(fā)展中的可能的分子機制，該研究為進一步以 Pim-3為靶點的肺腺癌病人的分子靶向治療提供理論依據(jù)和實驗證據(jù)。
　　方法
　?。?）采用免疫組織化學(xué)方法檢測97例正常肺組織以及97例肺腺癌組織中Pim-3蛋白的表達，并分析Pim-3蛋白的表達與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系。
　

11、?。?）采用Western blotting檢測隨機選取的4例肺腺癌組織和相對應(yīng)的正常組織中Pim-3蛋白的表達。
　?。?）采用脂質(zhì)體2000將對照siRNA（100 nM）和Pim-3 siRNA（100 nM）分別轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細胞，將細胞分為3組，即未處理的A549細胞組、對照siRNA組和Pim-3 siRNA組，采用Western blotting檢測不同組別的肺腺癌A549細胞中Pim-3蛋白的表達。
　　

12、（4）采用新型的 CCK-8試劑盒分析 siRNA轉(zhuǎn)染前后不同組別的肺腺癌A549細胞增殖的改變。
　　（5）采用流式細胞術(shù)分析不同組別的肺腺癌 A549細胞的細胞周期以及細胞凋亡的變化。
　?。?）采用Western blotting技術(shù)檢測3組不同的A549細胞中STAT3信號途徑的活化狀態(tài)及其下游靶基因p21、cyclin D1、Bcl-2和Bax的表達。
　　（7）統(tǒng)計學(xué)分析：所有的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計

13、軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x?s）表示，免疫組織化學(xué)結(jié)果采用卡方分析，多個樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05具有顯著性。
　　結(jié)果
　　（1）在97例肺腺癌組織中Pim-3蛋白的陽性表達例數(shù)為85例，其陽性表達率為87.63%，而97例正常組織中Pim-3蛋白的的陽性表達例數(shù)為8例，其陽性表達率為8.25%，二者之間 Pim-3蛋白的陽性表達率具有顯著性差異（X2=

14、122.456，P=0.000），這與Western blotting檢測的隨機4例肺腺癌組織和相對應(yīng)的正常組織中的結(jié)果一致。
　　（2）Pim-3蛋白表達與肺腺癌病人的年齡和性別無關(guān)（P>0.05），但與肺腺癌病人的組織學(xué)分化、TNM分期、組織學(xué)分型以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切（P<0.05）。
　?。?）與未處理的A549細胞和對照siRNA組相比，Pim-3 siRNA組中Pim-3蛋白的表達顯著降低（P<0.05），而未處

15、理的A549細胞和對照siRNA組相比， Pim-3蛋白的表達無差異（P>0.05）。
　?。?）與未處理的A549細胞和對照siRNA組相比，Pim-3 siRNA組中肺腺癌A549細胞的增殖顯著受到抑制（P<0.05），而未處理的肺腺癌A549細胞和對照siRNA組相比，A549細胞的增殖無差異（P>0.05）。
　　（5）Pim-3 siRNA組中G0/G1期的細胞數(shù)的比率（61.29±0.87%）顯著高于未處理的A5

16、49細胞（46.76±1.58%）和對照siRNA組（48.37±0.87%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=142.482，P=0.000）。此外，Pim-3 siRNA組中S期的細胞數(shù)的比率（25.05±1.22%）顯著低于未處理的A549細胞（31.55±1.11%）和對照siRNA組（31.83±0.89%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=37.756，P=0.000）。
　　（6）Pim-3 siRNA組中早期凋亡的細胞數(shù)比率（24

17、.39±1.20%）顯著高于未處理的A549細胞（7.02±0.60%）和對照siRNA組（7.39±0.34%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=462.594，P=0.000），而未處理的A549細胞和對照siRNA組之間早期凋亡的細胞數(shù)比率無差異（P>0.05）。
　?。?）Pim-3表達下調(diào)顯著降低肺腺癌A549細胞中STAT3的磷酸化水平，但不改變總的STAT3的表達。此外，Pim-3表達下調(diào)顯著降低肺腺癌A549細胞中cycl