線粒體核糖體蛋白S5(MRPS5)對膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、研究背景及目的:膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占泌尿系惡性腫瘤的90％以上，占全身惡性腫瘤的1％-2％，是一種直接威脅患者生命的疾病。膀胱癌病理類型主要是尿路上皮癌，根據(jù)其浸潤深度可分為非肌層浸潤性和肌層浸潤性膀胱癌兩種類型。初診患者中70％-80％為分化良好的非肌層浸潤性癌，臨床主要采取經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)輔以膀胱內(nèi)灌注化療方法治療，總體預(yù)后較好，僅10％進(jìn)展為肌層浸潤性癌，但術(shù)后復(fù)發(fā)率很高，需要時(shí)常監(jiān)測，因此造成巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)

2、;肌層浸潤性膀胱癌惡性程度高，治療金標(biāo)準(zhǔn)是根治性膀胱切除術(shù)，同時(shí)輔以系統(tǒng)性化療，盡管如此，其術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率達(dá)50％，5年生存率僅27％-50％，且長期化療毒副作用大、因此總體預(yù)后很差，所以發(fā)現(xiàn)新的診斷及治療方式顯得尤為重要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)癌基因、抑癌基因、小分子RNA等均可參與膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展，然而由于分子特異性差靶向基因治療并未取得良好的療效，因此人們亟待發(fā)現(xiàn)新的特異的診療靶標(biāo)。
　　膀胱癌的發(fā)生

3、機(jī)制非常復(fù)雜，包括癌基因c-Myc、h-ras、EGFR、HER2等的激活和抑癌基因p21、p53、Rb、p16ink4a/p19ink4b等的失活，近年來的研究發(fā)現(xiàn)某些線粒體DNA和能量代謝相關(guān)的蛋白也能參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如線粒體蛋白質(zhì)翻譯延伸因子Tu(TUFM)、細(xì)胞色素B(Cytb)、線粒體DNA亞基ND6等，這也使得線粒體與腫瘤的關(guān)系研究受到極大關(guān)注;同時(shí)研究也證實(shí)線粒體功能異常是惡性腫瘤的一大特點(diǎn)，這不僅歸功于癌基因/抑癌

4、基因的調(diào)控，還與腫瘤組織內(nèi)缺氧微環(huán)境相關(guān)。缺氧普遍存在于實(shí)體腫瘤甚至血液系統(tǒng)腫瘤中，它能夠調(diào)控線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致線粒體基因的功能改變，從而影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝及生物學(xué)行為。線粒體核糖體蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5，MRPS5)屬于真核細(xì)胞線粒體核糖體28S小亞基成員，位于2p11.2-q11.2，含430個(gè)氨基酸，分子量48KDa，主要功能是參與合成線粒體氧化磷酸化的13種蛋白。

5、最近的研究發(fā)現(xiàn)MRPS5通過線粒體能量代謝障礙途徑調(diào)控線蟲及小鼠的壽命。已知衰老是腫瘤發(fā)生的易感因素，如膀胱癌發(fā)病率隨年齡增加而增加;且長壽調(diào)控基因Sir2、daf-2、lin2、dct2、nnt-1等均參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)，前已述及線粒體結(jié)構(gòu)異常或功能障礙是腫瘤的重要特征，而MRPS5作為線粒體結(jié)構(gòu)組分且通過線粒體機(jī)能障礙途徑參與調(diào)控動(dòng)物的壽命，我們由此推測它可能與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。關(guān)于MRPS5對膀胱癌的生物學(xué)行為的影

6、響國內(nèi)外尚無報(bào)道，因此，我們對其功能開展了初步的研究。本研究中，我們首先對MRPS5在膀胱癌及癌旁正常組織中的表達(dá)以及MRPS5受缺氧影響的情況進(jìn)行了觀察，在此基礎(chǔ)上，通過慢病毒載體技術(shù)干擾膀胱癌T24細(xì)胞中MRPS5的表達(dá)，探討常氧及缺氧下MRPS5對膀胱癌細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)行為的影響，旨在為膀胱癌的診療提供新的潛在靶標(biāo)。
　　研究方法與主要內(nèi)容:
　　一、檢測MRPS5在膀胱癌組織及缺氧T24細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　膀胱

7、癌及其配對癌旁組織來自第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院泌尿外科行膀胱癌手術(shù)的患者，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得患者知情同意。采用Western Blot技術(shù)檢測這12對膀胱癌及癌旁正常組織中MRPS5的表達(dá)情況;同時(shí)，膀胱癌T24細(xì)胞經(jīng)常氧(21％ O2)和缺氧(1％O2)處理(24hr)后，利用Western Blot分別檢測MRPS5表達(dá)。
　　二、干擾MRPS5對常氧和缺氧下膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　為探討MRPS5對T24

8、細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們構(gòu)建了慢病毒干擾載體Lv-shMRPS5。以事先備好的Lv-shScramble為對照，慢病毒干擾載體Lv-shMRPS5感染T24細(xì)胞72hr后，用Western Blot檢測MRPS5的表達(dá)以確認(rèn)干擾載體的有效性。T24細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(Lv-shMRPS5)及對照組(Lv-shScramble)，分別在常氧(21％ O2)和缺氧(1％O2)下培養(yǎng)。T24細(xì)胞經(jīng)各慢病毒感染72hr后，Western Blot

9、檢測T24中HIF-1、PDK1、PKM2等與糖酵解相關(guān)的蛋白表達(dá)，以CellTiter-Blue Cell Viability Assay檢測細(xì)胞活力，Western Blot檢測增殖細(xì)胞核抗原PCNA的表達(dá)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及周期分布，Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力，Western Blot檢測上皮間質(zhì)化(Epithelial-Mesenchymal Transitions，EMT)相關(guān)蛋白ZEB1、Slug、vim

10、entin表達(dá)，超低粘附96孔板細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)反映細(xì)胞成球能力，Western Blot檢測干性相關(guān)蛋白Nanog、Oct4、c-Myc、Sox2的表達(dá)， NOD/SCID小鼠皮下種植T24細(xì)胞以反映T24細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:MRPS5在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且缺氧(1％O2)能刺激T24細(xì)胞MRPS5表達(dá)。構(gòu)建的慢病毒干擾載體能降低T24細(xì)胞中MRPS5表達(dá)。常氧和缺氧時(shí)，干擾T24細(xì)胞中MRPS5

11、的表達(dá)均可降低HIF-1、PDK1、PKM2等與糖酵解相關(guān)的蛋白，細(xì)胞增殖活力下降(P＜0.05)，PCNA表達(dá)顯著減少，而細(xì)胞周期阻滯于S期，細(xì)胞早期凋亡率明顯增加。常氧下Transwell結(jié)果顯示干擾MRPS5對T24細(xì)胞的遷移能力無影響，且EMT相關(guān)蛋白ZEB1、Slug、vimentin表達(dá)也均無改變。細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)顯示，干擾MRPS5后兩組成球率無差異(P＞0.05)但細(xì)胞球直徑明顯減小，同時(shí)常氧及缺氧時(shí)干性轉(zhuǎn)錄因子Nanog、

12、Oct4、c-Myc、Sox2的表達(dá)也隨之下調(diào)。小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾MRPS5后小鼠成瘤時(shí)間延遲，且6周后瘤體平均重量較輕(P＜0.05)、體積較小(P＜0.05)。
　　結(jié)論:膀胱癌組織中MRPS5表達(dá)水平較高。干擾膀胱癌T24細(xì)胞MRPS5的表達(dá)可顯著下調(diào)糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞增殖能力，減弱細(xì)胞的干性特征，降低其在小鼠體內(nèi)的成瘤能力，但不影響膀胱癌T24細(xì)胞的遷移能力。缺氧可提高T24細(xì)胞MRPS5的表達(dá)，干