Bioko島惡性瘧原蟲AMA-1與EBA-175的基因多態(tài)性研究.pdf

1、背景：
　　AMA1和EAB-175是惡性瘧原蟲入侵紅細(xì)胞的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白，同時(shí)也是當(dāng)前研制瘧疾疫苗的主要靶點(diǎn)。由于兩個(gè)抗原均具有高度的多態(tài)性，研究非洲不同地區(qū)惡性瘧原蟲（Pf）的裂殖子頂端膜抗原1（apical membrane antigen-1, AMA-1）Ⅰ區(qū)基因序列特征，初步探討其多態(tài)性形成的原因和機(jī)制，為進(jìn)一步了解Pf AMA1基因多態(tài)性的分布情況并為瘧疾疫苗的研制提供了一定的分子基礎(chǔ)。了解該地區(qū)惡性瘧原蟲紅細(xì)胞結(jié)合抗

2、原175（erythrocyte binding antigen-175）Ⅲ區(qū)中F片段和C片段出現(xiàn)的頻率（在單個(gè)瘧原蟲中有且僅有一個(gè)F片段或C片段會(huì)出現(xiàn)），以探討不同蟲株感染與宿主體內(nèi)蟲密度之間的關(guān)聯(lián)性。
　　方法：
　　使用免疫膠體金法試劑盒和顯微鏡鏡檢(WHO規(guī)定確診瘧原蟲的標(biāo)準(zhǔn)方法)及熒光定量PCR進(jìn)行了蟲種鑒定，篩選確診為惡性瘧原蟲感染的病例。征得患者同意后，收集患者手指末梢血2-3滴，滴于濾紙上，待濾紙干燥后，編碼

3、并記載各個(gè)病人病案記錄后收入塑料密封袋中制備干血片，室溫下干燥后置于-80℃冰箱凍存。采用Chelex-100提取濾紙血樣中的DNA，制備實(shí)驗(yàn)樣本。巢式PCR擴(kuò)增Pf AMA1Ⅰ區(qū)(498bp)和惡性瘧原蟲EBA175Ⅲ區(qū)（F片段和C片段，長(zhǎng)度分別為795bp和714bp）。凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化并測(cè)序。使用 DnaSP5.10、MEGA5.0等在線生物軟件將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析并討論。
　　結(jié)果：
　　Bioko

4、島51例惡性瘧原蟲樣本中有41種AMA1單倍型(H=41)，其中有24種單倍型在基因庫(kù)中無100％吻合序列，多態(tài)位點(diǎn)（S）為45個(gè)，核苷酸多樣度（π）為0.028±0.001；在41例非洲大陸國(guó)家樣本中有31種AMA1單倍型(H=31)，其中有9種單倍型在基因庫(kù)中無100%吻合序列，多態(tài)位點(diǎn)（s）為40個(gè)，核苷酸多樣度（π）為0.027±0.001。兩組樣本中性檢驗(yàn)結(jié)果中除了MK檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組樣本連鎖不平衡指

5、數(shù)R2隨著核苷酸遺傳距離增加出現(xiàn)下降趨勢(shì)。
　　對(duì)Bioko島樣本的EBA-175Ⅲ區(qū)F/C片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序成功的樣本為134個(gè)。將樣本數(shù)按F片段感染、C片段感染以及F/C混合感染分為3組，分別為110例（82.1%），15例（11.2%）和9例（6.7%）。使用單因素方差分析檢驗(yàn)3組樣本的瘧原蟲密度是否有差異，結(jié)果顯示混合感染組蟲密度分別與另外兩組蟲密度之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而F片段感染與C片段感染病例之間的蟲密度差異無統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義。使用秩和檢驗(yàn)對(duì)不同年齡段患者蟲密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)不同年齡段患者之間蟲密度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　惡性瘧原蟲樣本頂端膜抗原1（AMA-1）Ⅰ區(qū)具有較高的核苷酸多態(tài)性和單倍型多態(tài)性，可作為惡性瘧原蟲研究的靶向分子，對(duì)了解惡性瘧原蟲的遺傳特征有一定的參考意義。Pf AMA-1Ⅰ區(qū)基因多態(tài)性的產(chǎn)生可能是自然選擇和基因內(nèi)重組共同作用的結(jié)果。研究結(jié)果為進(jìn)一步了解瘧疾流行特征及瘧疾疫苗的研制提供了分子基礎(chǔ)。EBA-17