支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)生菌的篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶能夠?qū)Ｒ恍缘乩弥ф湴被徇M行轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，在α-酮酸的合成、手性氨基酸對映體的拆分和氨基酸的生物合成等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值，其研究已受到國內(nèi)外的廣泛重視。本文系統(tǒng)開展了關(guān)于產(chǎn)酶菌株篩選，發(fā)酵產(chǎn)酶條件、轉(zhuǎn)氨反應(yīng)條件優(yōu)化和產(chǎn)酶菌的生長動力學(xué)的研究，為深入開展支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 本研究通過對公廁附近的土壤樣品進行篩選，由篩選平板分離到274株菌落較大的菌株，驗證轉(zhuǎn)化產(chǎn)物后得到14株進入復(fù)篩，選出一株

2、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶活性相對較高的菌株WJ44。通過對菌落形念的觀察、16SrRNA序列的比對和系統(tǒng)發(fā)育分析、生理生化實驗，鑒定WJ44菌株為一株蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，命名為BacilluscereusWJ44。 通過單因素實驗和響應(yīng)面實驗確定了BacilluscereusWJ44發(fā)酵產(chǎn)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的最佳培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20.99g/L，蛋白胨16.85g/L，牛肉膏5g/L，玉米漿18.24g/L，

3、KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L；最佳培養(yǎng)條件為：初始pH7.0，培養(yǎng)溫度37℃，裝液量20mL/250mL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，接種量3％。WJ44菌株在最佳培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10h，其支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶活力即可達45.79U/mL，菌體干重8.64g/L，分別比原來提高了40％與10％，是一株產(chǎn)酶和生長性能較佳的菌株。 利用單因素實驗和正交實驗確定了全細胞酶催化的的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的最佳條件為

4、：底物L(fēng)—亮氨酸15g/L，丙酮酸12g/L，酶液與底物溶液的配比1:1(V：V)，表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨3g/L，輔酶5’—磷酸吡哆醛0.04mmol/L，轉(zhuǎn)氨反應(yīng)溫度40℃，底物溶液起始pH9.0。金屬離子對轉(zhuǎn)氨反應(yīng)均有一定程度的抑制作用，Cu2+的抑制作用尤為明顯。在最佳條件下轉(zhuǎn)氨反應(yīng)8h，產(chǎn)物α-酮異己酸濃度即可達5.63g/L。 通過對BacilluscereusWJ44在連續(xù)培養(yǎng)中的生長動力學(xué)特性研究，發(fā)現(xiàn)以