聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)生菌的篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、化學(xué)合成塑料的產(chǎn)生給人類(lèi)的生活帶來(lái)了極大的便利,但其生物難降解性也帶來(lái)了嚴(yán)重的白色污染,同時(shí)其原材料-石油資源也日益緊缺。因此,化學(xué)合成塑料的替代品-可降解塑料的研究與開(kāi)發(fā)就顯得越來(lái)越重要。聚羥基脂肪酸酯(PHA)作為一種具有廣闊應(yīng)用前景的石油基塑料的替代品,目前已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。PHA是微生物在營(yíng)養(yǎng)不均衡的條件下合成的一種胞內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)。由于PHA的生物可降解性、無(wú)毒且環(huán)境友好等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于眾多領(lǐng)域,如環(huán)境、生物醫(yī)學(xué)、造

2、紙、電子、光學(xué)等。
　　就目前PHA研究狀況而言,獲得高產(chǎn)、高轉(zhuǎn)化率的微生物菌株仍然是聚羥基脂肪酸酯生產(chǎn)及應(yīng)用的關(guān)鍵。本文通過(guò)對(duì)自然界土樣進(jìn)行微生物的篩選,成功地獲得一株聚羥基脂肪酸酯生產(chǎn)菌,通過(guò)16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析等分子生物學(xué)鑒定手段,最終將其命名為Rhizobium sp.H2-5。隨后對(duì)菌株Rhizobium sp.H2-5進(jìn)行了發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)條件優(yōu)化,以提高其PHA提取率;并分析了不同發(fā)酵方式對(duì)菌株Rhizob

3、ium sp.H2-5的PHA提取率的影響,擴(kuò)大了PHA生產(chǎn)菌株資源。
　　本文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)生菌的篩選及鑒定。從自然界中取樣,經(jīng)過(guò)尼羅藍(lán)熒光平板初篩、蘇丹黑染色復(fù)篩,成功篩選出一株聚羥基脂肪酸酯產(chǎn)生菌H2-5。提取菌株H2-5胞內(nèi)產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜分析以及元素分析,最后證實(shí)菌株H2-5胞內(nèi)提取物為聚羥基脂肪酸酯。隨后提取菌株H2-5的基因組DNA進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定及blast比對(duì)

4、,結(jié)果表明菌株H2-5屬于根瘤菌屬,并將其命名為Rhizobium sp.H2-5。
　　形態(tài)學(xué)特征顯示:H2-5菌體呈桿狀,革蘭氏染色呈陰性,不產(chǎn)芽孢。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上的菌落呈圓形,表面光滑,大小均一,邊緣整齊,菌落呈淡黃色,半透明。菌株H2-5生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:菌株H2-5不能水解淀粉作為碳源,也不能利用檸檬酸鹽,甲基紅實(shí)驗(yàn)與V.P實(shí)驗(yàn)均成陰性,生長(zhǎng)過(guò)程中不產(chǎn)生硫化氫,在形成芽孢的培養(yǎng)基上(淡薄培養(yǎng)基)生長(zhǎng)良好,

5、但不產(chǎn)生芽孢。生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果表明:菌株的適應(yīng)期很短,接種3h后就進(jìn)入對(duì)數(shù)期,接種18h左右就達(dá)到穩(wěn)定期,所以菌株H2-5有適應(yīng)期短,生長(zhǎng)快速的特點(diǎn)。
　　2.菌株Rhizobium sp.H2-5發(fā)酵條件的優(yōu)化。首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了菌株Rhizobium sp.H2-5發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件,結(jié)果顯示最佳碳源為葡萄糖,最佳氮源為蛋白胨。從中選出4個(gè)對(duì)PHA提取率有較大影響的因素,分別為發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵溫度、接種量以及碳

6、氮比。通過(guò)對(duì)這4個(gè)參數(shù)的四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)及SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,確定最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0,發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時(shí)間為39h,裝液量為100mL/500mL三角瓶,接種量為4％,碳氮比為100/4。對(duì)以上得出的最佳條件進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證,結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)論相近。其PHA的產(chǎn)量可達(dá)到細(xì)胞干重的50％以上,PHA提取率較優(yōu)化前提高了20％-22％。
　　3.菌株Rhizobium sp.H2-5發(fā)酵過(guò)程控制研究。在發(fā)酵