sTNFRⅡ-adiponectin融合蛋白的制備及其生物學功能的初步研究.pdf

1、目的：
　　本課題通過對中國專利（專利號ZL200510100468.9）中的融合蛋白人可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ胞外區(qū)與人脂聯(lián)素球部的融合基因（sTNFRⅡ-gAD）進行改造，旨在構建一種新型的雙功能融合蛋白，即可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ-脂聯(lián)素融合蛋白即sTNFRⅡ-adiponectin。該蛋白利用脂聯(lián)素能自發(fā)形成同源三聚體的特性，增加了腫瘤壞死因子受體Ⅱ與TNFα的親和力，并通過利用富含“GC”的載體系統(tǒng)高效表達蛋白，同時還探

2、索了無血清懸浮流加培養(yǎng)的方法，為高效、快速獲取該融合蛋白的大規(guī)模懸浮流加培養(yǎng)工藝奠定基礎。
　　方法：
　　1. 獲取sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT基因
　　通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，從人脂肪組織中獲取脂聯(lián)素cDNA。以該基因為模版，分別得到野生型和突變型adiponectin。再以實驗室之前得到的pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc為模版，擴增sT

3、NFRⅡ，將兩者融合，得到sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT基因。
　　2. 構建PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-MT表達質粒
　　PCR擴增目的基因sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNF

4、RⅡ-adiponectin-MT,構建PMD18-T克隆載體，轉化入大腸桿菌進行擴增，提質粒得到大量sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT目的基因，將其酶切后分別連入PMH3、PCA表達載體，得到PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、 PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adipo

5、nectin-MT表達質粒。
　　3. 建立表達sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白的高表達CHO細胞株
　　通過電轉化的方法，將成功構建的表達質粒轉入CHO-S細胞，經(jīng)過篩選得到高表達sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白的細胞株。
　　4. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-ad

6、iponectin-MT融合蛋白的獲取
　　4.1 貼壁培養(yǎng)
　　篩選出的高表達株于T75中貼壁培養(yǎng)，收集細胞上清，利用鎳柱純化獲取目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT，透析過夜后超濾管濃縮蛋白，并通過Western-blot、考馬斯亮藍染色法鑒定目的蛋白大小。
　　4.2 懸浮培養(yǎng)初探
　　將T75中貼壁培養(yǎng)的高表達株進行B001懸浮馴化，得到適合懸浮生

7、長的穩(wěn)定高表達工程細胞株。
　　5. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白活性的測定通過MTT法測定sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT中和TNF-α殺傷L929細胞的活性，比較目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT、標準蛋白sTNFRⅡ-Fc以及實驗室原先構建的蛋白s

8、TNFRⅡ-gAD-Fc、sTNFRⅡ-gAD拮抗TNFα的能力的差異。
　　結果：
　　1. 成功得到sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT基因RT-PCR后用1.2％的瓊脂糖檢測結果，成功得到與預期條帶大小一致的片段。
　　2. 成功構建PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、PCA-sTNFRⅡ-a

9、diponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-MT表達質粒
　　提質粒酶切后，用1.2％的瓊脂糖鑒定酶切結果，得到條帶與預期位置相符，將該質粒送測序鑒定目的基因，與NCBI上獲取的基因序列比對后完全一致，提示成功構建PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-WT、PMH3-sTNFRⅡ-adiponectin-MT、PCA-sTNFRⅡ-adiponectin-WT和PCA-sTNFRⅡ-adip

10、onectin-MT表達質粒。
　　3. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白在CHO細胞中高表達
　　電轉染后的細胞經(jīng)過單克隆化后用G418加壓篩選，通過Dot-Blot篩選高表達株，經(jīng)過2輪篩選后，挑選表達量高的細胞株擴增培養(yǎng)，能得到高表達目的蛋白的細胞株。
　　4. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合

11、蛋白的純化
　　鎳柱純化時，目的蛋白約在120mM左右濃度的咪唑洗脫下來，純化后成功得到目的蛋白。經(jīng)過WB鑒定，目的蛋白單體大小為70KD左右，并且以多聚體的形式存在。
　　5. sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白活性的測定
　　sTNFRⅡ-adiponectin-WT和sTNFRⅡ-adiponectin-MT融合蛋白具有顯著抑制TNFα殺傷L929細胞的

12、活性，且隨蛋白濃度的升高，抑制TNFα殺傷L929細胞越明顯，即呈劑量依賴性。相對于標品sTNFRⅡ-Fc來說，目的蛋白活性明顯較強，但活性還是低于之前實驗室構建的融合蛋白sTNFRⅡ-gAD。
　　結論:
　　本實驗成功構建了sTNFRⅡ-adiponectin-WT、sTNFRⅡ-adiponectin-MT真核表達載體，并在CHO細胞中得到蛋白表達，已篩選出高表達單克隆細胞株。收取細胞上清，經(jīng)過鎳柱純化獲得一定體積的蛋