lncRNA-ANCR對人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose Tissue-Derived Stem Cell，ADSC)是從脂肪組織中分離出來的一種中胚層來源的多能干細(xì)胞。因其具有來源充足、取材方便、易于培養(yǎng)、多向分化和免疫調(diào)節(jié)等眾多優(yōu)點(diǎn)，已成為間充質(zhì)干細(xì)胞研究與應(yīng)用的熱點(diǎn)。ADSC可用于多種組織器官的損傷修復(fù)和再生，例如用于皮膚、骨與軟骨、肌腱與韌帶、周圍神經(jīng)等組織的損傷修復(fù)等。ADSC的增殖、多向分化、向損傷部位遷移等生物學(xué)特性是影響其

2、發(fā)揮損傷修復(fù)功能的關(guān)鍵因素。應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)治療組織損傷時，往往是在炎癥環(huán)境中發(fā)揮其損傷修復(fù)的功能，炎癥因子將影響MSC的生物學(xué)特性進(jìn)而影響其組織修復(fù)與再生功能。因此，炎癥環(huán)境下ADSC生物學(xué)特性的改變和調(diào)節(jié)也受到越來越多的關(guān)注。
　　近年來的研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(Long Noncoding RNA，lncRNA)在調(diào)控干細(xì)胞基因表達(dá)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色。lncR

3、NA-ANCR/DANCR(Anti-differetiation Noncoding RNA，ANCR)在人體多種組織中廣泛表達(dá)，并在不同組織來源的干細(xì)胞中發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。例如研究發(fā)現(xiàn)ANCR可以抑制表皮分化，抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell，BMSC)的成骨分化以及牙體組織來源干細(xì)胞(Dental Tissue-Derived Stem Cell，DTSC)的成脂、成骨

4、和成神經(jīng)分化，卻促進(jìn)滑膜組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Synovium-Derived MSC，SMSC)的增殖和成軟骨分化。ANCR對人ADSC(hADSC)生物學(xué)特性的影響還尚未見報道。
　　此外，在前期研究中發(fā)現(xiàn)與炎癥密切相關(guān)的地塞米松促進(jìn)ANCR在hADSC中的表達(dá)，猜測ANCR可能也會受到微環(huán)境中炎癥因子的調(diào)控。因此，篩選影響ANCR表達(dá)的炎癥因子后，應(yīng)用地塞米松和TNF-α刺激hADSC，觀察ANCR在hADSC生物學(xué)特性發(fā)

5、生改變過程中的作用，并初步探討了相關(guān)機(jī)制。本研究豐富了炎癥環(huán)境下hADSC生物學(xué)特性發(fā)生改變的相關(guān)機(jī)制的研究，為hADSC在組織損傷中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　研究目的:
　　1.探討ANCR對hADSC增殖、周期、凋亡、遷移以及成脂、成骨分化等生物學(xué)特性的調(diào)控作用。
　　2.檢測地塞米松對hADSC中ANCR表達(dá)水平的影響，探討ANCR在地塞米松誘導(dǎo)的hADSC細(xì)胞生物學(xué)特性改變中發(fā)揮的作用。
　　3.篩選影響

6、hADSC中ANCR表達(dá)的炎癥因子，探討ANCR在TNF-α誘導(dǎo)的hADSC細(xì)胞生物學(xué)特性改變中發(fā)揮的作用。
　　4.初步探討TNF-α、地塞米松調(diào)控hADSC中ANCR表達(dá)的機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.ANCR對hADSC生物學(xué)特性的影響
　　從抽脂術(shù)后廢棄的脂肪組織中獲取血管基質(zhì)成分SVF(Stromal Vascular Fraction)，并用干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸后貼壁培養(yǎng)獲得hADSC。流式分析儀對P3

7、代hADSC進(jìn)行表面標(biāo)志物的檢測。
　　構(gòu)建ANCR的敲減與過表達(dá)質(zhì)粒，利用慢病毒感染的方式敲減和過表達(dá)hADSC中的ANCR后，CCK-8法檢測hADSC增殖、Muse細(xì)胞狀態(tài)分析儀檢測細(xì)胞周期、Annexin-Ⅴ和7-AAD染色之后用Muse細(xì)胞狀態(tài)分析儀檢測細(xì)胞凋亡水平的變化、細(xì)胞劃痕實(shí)驗檢測細(xì)胞遷移能力的改變、成脂誘導(dǎo)后7天進(jìn)行油紅O染色鑒定成脂效果、成骨誘導(dǎo)后14天進(jìn)行茜素紅染色鑒定成骨效果。
　　2.地塞米松對h

8、ADSC生物學(xué)特性的影響以及ANCR在其中的作用
　　體外添加1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L三種濃度的地塞米松處理hADSC后，檢測hADSC的增殖、周期、凋亡、遷移等生物學(xué)特性的改變，以及Real-time PCR檢測各組hADSC中ANCR、成脂相關(guān)基因(PPARγ，C/EBPα)、成骨相關(guān)基因（RUNX2，ALP)、增殖、周期、凋亡相關(guān)基因以及趨化因子受體（CXCR4，CXCR7）的表

9、達(dá)。
　　3.TNF-α對hADSC生物學(xué)特性的影響以及ANCR在其中的作用
　　體外分別添加TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6、IL-8、MCP-1六種促炎因子以及IL-13、IL-10兩種抑炎因子，Real-time PCR檢測hADSC中ANCR的表達(dá)。
　　體外添加10ng/ml和50ng/ml的TNF-α處理hADSC后，檢測hADSC的增殖、周期、凋亡、遷移、成脂、成骨分化等生物學(xué)特性的改變，以及

10、Real-time PCR檢測各組hADSC中增殖、周期、凋亡、遷移、成脂以及成骨相關(guān)基因的表達(dá)。
　　在hADSC中過表達(dá)ANCR后添加10ng/ml TNF-α刺激并檢測hADSC增殖、周期和遷移的改變，Real-time PCR檢測增殖、周期和遷移相關(guān)基因的表達(dá)。
　　4.TNF-α、地塞米松調(diào)控hADSC中ANCR表達(dá)的機(jī)制
　　10ng/ml TNF-α刺激hADSC，不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞，Western Bl

11、ot檢測NF-κB(Nuclear factorκB)和mTOR（Mammalian Target of Rapamycin）信號通路活化情況。分別應(yīng)用NF-κB通路的抑制劑BAY11-7082、地塞米松以及mTOR通路抑制劑雷帕霉素(Rapamycin)和PP242預(yù)處理hADSC，再加入10ng/ml TNF-α刺激后，Western Blot檢測相應(yīng)信號通路是否被抑制以及Real-time PCR檢測ANCR的表達(dá)水平。
　

12、　研究結(jié)果:
　　1.ANCR對hADSC生物學(xué)特性的影響
　　P3代hADSC中，MSC表面標(biāo)志分子CD44、CD73、CD90、CD105等的表達(dá)均在95％以上，CD45等造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)為陰性。
　　敲減ANCR促進(jìn)hADSC的增殖，增加S期的細(xì)胞比例、降低G0/G1期的細(xì)胞比例，促進(jìn)hADSC的遷移以及成脂、成骨分化。過表達(dá)ANCR抑制hADSC的增殖，降低S期的細(xì)胞比例、增加G0/G1期的細(xì)胞比例，

13、抑制hADSC的遷移以及成脂、成骨分化。敲減和過表達(dá)ANCR對hADSC的細(xì)胞凋亡狀態(tài)都無顯著影響。
　　2.地塞米松對hADSC生物學(xué)特性的影響以及ANCR在其中的作用
　　地塞米松促進(jìn)hADSC中ANCR的表達(dá)，并且隨著地塞米松濃度的增加而升高。高濃度地塞米松（1×10-6mol/L，1×10-7mol/L）抑制hADSC的增殖，減少S期的細(xì)胞比例、升高G0/G1期細(xì)胞比例，抑制hADSC的遷移，促進(jìn)hADSC的凋亡以及

14、成脂相關(guān)基因PPARγ和C/EBPα的表達(dá)。低濃度地塞米松(1×10-8mol/L)促進(jìn)hADSC中成骨相關(guān)基因RUNX2和ALP的表達(dá)，對hADSC增殖、周期、凋亡以及遷移沒有顯著的影響。
　　敲減ANCR可以減弱1×10-7mol/L地塞米松對hADSC增殖、周期、遷移的抑制作用。
　　3.TNF-α對hADSC生物學(xué)特性的影響以及ANCR在其中的作用
　　TNF-α、IL-1β、IFN-γ可以降低hADSC中AN

15、CR的表達(dá)水平。10ng/ml和50ng/ml TNF-α促進(jìn)hADSC增殖，增加S期的細(xì)胞比例、降低G0/G1期的細(xì)胞比例，促進(jìn)hADSC中凋亡抑制因子NF-κB的表達(dá)及其凋亡拮抗作用，促進(jìn)hADSC細(xì)胞遷移能力，抑制hADSC成脂、成骨分化。
　　ANCR的過表達(dá)可以減弱TNF-o對hADSC細(xì)胞增殖、周期、遷移的促進(jìn)作用。
　　4.TNF-α、地塞米松調(diào)控hADSC中ANCR表達(dá)的機(jī)制
　　TNF-α可以激活hA

16、DSC中NF-κB和mTOR信號通路，NF-κB和mTOR通路的活化可以分別被BAY11-7082、地塞米松以及Rapamycin、PP242抑制。BAY11-7082和地塞米松可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的hADSC中ANCR的下降，并且單獨(dú)作用時可以通過抑制NF-κB信號通路促進(jìn)hADSC中ANCR的表達(dá)，Rapamycin和PP242則無此作用。
　　研究結(jié)論:
　　1.ANCR可以調(diào)控hADSC的增殖、周期、遷移以及成脂、

17、成骨分化能力。
　　2.地塞米松濃度依賴性的促進(jìn)hADSC中ANCR的表達(dá)，并且敲減ANCR可以減弱1×10-7mol/L地塞米松對hADSC增殖、周期以及遷移的抑制作用。提示ANCR可能參與高濃度地塞米松對hADSC增殖、周期以及遷移的調(diào)控。
　　3.促炎因子TNF-α可以降低hADSC中ANCR的表達(dá)，并且ANCR的過表達(dá)可以減弱TNF-α對hADSC增殖、周期以及遷移的促進(jìn)作用。提示ANCR可能會參與TNF-α對hAD