胃癌血清蛋白標(biāo)記物的篩選、鑒定及生物學(xué)特性研究.pdf

1、1、研究背景：
　　胃癌（Gastric Cancer）是世界上發(fā)病率最高的腫瘤之一，我國胃癌的發(fā)病率也居高不下。相對與國外而言我國的胃癌以局部進(jìn)展期和晚期居多，早期患者較少，總體生存率明顯低于國外。如何提高胃癌患者的早診早治是目前國內(nèi)研究的熱點(diǎn)問題。因?yàn)樵缙谖赴]有明顯的臨床表現(xiàn)，胃癌的早期臨床表現(xiàn)也常常與胃炎相混淆，所以大多數(shù)胃癌患者即使腫瘤發(fā)展至進(jìn)展期或者晚期，也沒有特異性臨床癥狀出現(xiàn)，因而依靠臨床表現(xiàn)診斷胃癌顯然無法實(shí)現(xiàn)。

2、目前在我國開展胃癌的早期診治尚未有一種快捷、有效的方法。雖然在日本等國家胃鏡篩查已經(jīng)成為中年以上人群的體檢項(xiàng)目，但由于檢查費(fèi)用高、存在一定痛苦及風(fēng)險(xiǎn)，在我國不能普及。一些常規(guī)的檢測指標(biāo)諸如CEA、CA199和CA724等用于消化道腫瘤檢測的腫瘤標(biāo)志性蛋白質(zhì)，也由于在普通人群中篩查的敏感性和特異性均不高的原因只能用于部分胃癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的監(jiān)測。目前尋找特異性腫瘤標(biāo)記物，尤其是在外周血中尋找對于胃癌有明確特異性的標(biāo)志性蛋白質(zhì)分子具有

3、很高的臨床價(jià)值。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）的概念早在1994年即被澳大利亞的研究人員Williams等提出，并首先將這一研究方法應(yīng)用于科學(xué)研究。它研究的是生物體在一定階段所擁有的全部蛋白質(zhì)，以及在生物體代謝的過程中不同蛋白質(zhì)的變化。不僅包括單個(gè)細(xì)胞在受到某些調(diào)控因子后其擁有的全部蛋白質(zhì)的差異性變化，也包括整個(gè)生物的機(jī)體在某些影響因素的作用下蛋白質(zhì)的差異性變化。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)作為基因轉(zhuǎn)錄的最終形式，不僅參與生命的的維持，更

4、是調(diào)節(jié)生命活動(dòng)具體形式的執(zhí)行者。對于蛋白質(zhì)譜的研究和完善有助于早期診斷某些疾病，也有助于研究治療這些疾病的生物學(xué)靶點(diǎn)和藥物。本研究從胃癌早期診斷入手，采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法對胃癌患者血清進(jìn)行研究，以期尋找出特異性蛋白標(biāo)記物，而有助于胃癌的早期診斷。再從可能出現(xiàn)的特異性蛋白質(zhì)入手，探索新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)是否參與胃癌的生長調(diào)節(jié)，以及對此類蛋白的調(diào)節(jié)能否作為胃癌可能的治療手段。
　　本研究對象是胃癌患者的血清(分別是胃癌患者術(shù)前血清，胃癌患

5、者術(shù)后血清)。擬通過表明增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）技術(shù)對三組胃癌血清以及正常血清進(jìn)行比對，尋找差異表達(dá)蛋白，構(gòu)造出差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜圖，再運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electr

6、ophoresis，SDS-PAGE）技術(shù)對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化分離后，對目標(biāo)蛋白用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF）技術(shù)進(jìn)行鑒定。最終確定胃癌患者血清中具有特異性的蛋白標(biāo)記物，并通過細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究明確其是否對胃癌細(xì)胞和組織的生長產(chǎn)生影響，為胃癌的診斷及

7、臨床治療提供了可能和依據(jù)。
　　2、研究目的：
　　通過蛋白組學(xué)技術(shù)篩選并鑒定胃癌患者血清中可能存在的特異性蛋白標(biāo)記物，通過細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究明確其是否對胃癌細(xì)胞和組織的生長產(chǎn)生影響。
　　3、材料與方法：
　　3.1臨床及實(shí)驗(yàn)資料
　　本研究材料收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普通外科自2013年5月至2014年1月前來就診的60例首診胃癌患者，其中男性患者46例，女性患者14例，年齡42~84歲，平均年齡5

8、8±0.5歲。術(shù)前經(jīng)胃鏡活檢病理證實(shí)為腺癌，CT、彩超等檢查排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且無手術(shù)禁忌擬行手術(shù)治療，于術(shù)前入院和術(shù)后1月復(fù)查時(shí)各采集血清標(biāo)本一次，分別設(shè)為術(shù)前組和術(shù)后組。所有患者采集標(biāo)本前均未接受化療、放療等治療，手術(shù)后病理再次確認(rèn)為胃腺癌，組織病理分型，14例患者高分化型腺癌，21例中分化型腺癌，25例低分化型腺癌。病理學(xué)診斷均經(jīng)過兩位以上的病理學(xué)專家的證實(shí)。20例慢性萎縮性胃炎患者血清，40例健康志愿者血清。所有120例患者的血樣標(biāo)

9、本均自清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取，血液抽取后將血樣放置于干燥試管中于室溫下靜置1小時(shí)使血液自然凝固，而后在離心機(jī)中以3000 r/min的速度進(jìn)行離心15min，抽取離心沉淀后的上清液移至PE管中，再將提取物置入-80℃冰箱進(jìn)行保存。本實(shí)驗(yàn)通過了河南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理審查，受試者均已簽署知情同意書。
　　本實(shí)驗(yàn)選取的MGC-803和HGC-27胃癌細(xì)胞株購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院的上海細(xì)胞庫。裸鼠BLAB/C nude購自北京維通利華動(dòng)

10、物技術(shù)有限公司，選用四-五周齡裸鼠，雌性20只，雄性20只，體重12-15g。
　　3.2主要試劑及儀器
　　用于目標(biāo)蛋白檢測的蛋白質(zhì)生物芯片系統(tǒng)（Ciphergen PBS II+SELDI–TOF–MS）以及WCX2蛋白芯片購買于美國Ciphergen Biosystem公司。SELDI–TOF–MS相關(guān)試劑購買于美國Sigma公司?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI–TOF–MS）購于美國Kratos Ana

11、lytical公司。Apo C-I購買于中國澤溪源生物科技有限公司。真空冷卻離心濃縮系統(tǒng)（SPD SpeedVac）購于美國Thermo Electron公司。1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購于以色列BI公司，McCoy5A培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國GIBCO公司。胰蛋白酶購于中國索萊寶公司。熒光顯微鏡購買于日本Olympus公司。高速低溫離心機(jī)購于日本HITACHI公司。Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresi

12、s System和Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell購于美國Bio-Rad Laboratories公司。IBM小Series360服務(wù)器（S/N：99WLWX4）購于美國IBM公司。鼠抗人血清（antiserum TTHY，一抗）、兔抗人血清（antiserum apoC-3，一抗）、抗鼠血清（二抗）和抗兔血清（二抗）購于美國santa cruz biotechno

13、logy公司。PVDF膜購于美國Millipore Corporation公司。
　　3.3實(shí)驗(yàn)方法
　　3.3.1胃癌血清蛋白標(biāo)記物的篩選：
　　隨機(jī)選取40例胃癌患者和20例健康志愿者作為訓(xùn)練組，用以篩選特征蛋白；其余20例胃癌患者、20例慢性萎縮性胃炎患者和20例健康志愿者作為測試組，用以驗(yàn)證目標(biāo)的有效性。采用SELDI-TOF-MS系統(tǒng)進(jìn)行檢測，以2000Da至20000Da為設(shè)定的最佳數(shù)據(jù)收集范圍，收集實(shí)驗(yàn)所

14、得到的每個(gè)樣本中差異蛋白質(zhì)的m/z峰值數(shù)據(jù)，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，根據(jù)計(jì)算到的P值大小進(jìn)行差異化分析，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)各組之間具有差異性的蛋白峰值。采用非線性支持向量機(jī)(SMV)分類器對各個(gè)樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立判別模型，再采用留一法交叉驗(yàn)證測試組60例患者所建立模型的有效性。
　　3.3.2胃癌血清差異性蛋白的純化及鑒定：
　　將處理好的血清標(biāo)本用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離，切取相應(yīng)的膠片部分，根據(jù)膠內(nèi)酶解試劑盒

15、說明書酶解出目標(biāo)蛋白。點(diǎn)樣在蛋白質(zhì)芯片板上，采用MALDI-TOF/TOF進(jìn)行鑒定，收集相應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖譜。通過Mascot搜索軟件，將采集的數(shù)據(jù)與SwissProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行連接、比對數(shù)據(jù)及匹配尋找相應(yīng)的特征性蛋白質(zhì)，從而獲得相應(yīng)的目標(biāo)蛋白質(zhì)。
　　3.3.3胃癌血清差異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的驗(yàn)證：
　　將待測樣本根據(jù)BCA蛋白濃度試劑盒使用說明書采用微孔酶標(biāo)儀法測定蛋白濃度，結(jié)果無明顯差異，采用等體積法加樣進(jìn)行Western

16、 blot試驗(yàn)，掃描負(fù)片，采用image proplus6.0軟件測定每條蛋白質(zhì)負(fù)片的灰度，采用SPSS，version13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各組間灰度值的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.3.4目標(biāo)蛋白對胃癌細(xì)胞株增殖的影響：
　　培養(yǎng)生長良好，處于對數(shù)增殖期的胃癌細(xì)胞。一組用不含目標(biāo)蛋白培養(yǎng)基，作為對照組，另外五組加入含不同濃度目標(biāo)蛋白的培養(yǎng)基，除此之外，加一組只有培養(yǎng)基100ul不含細(xì)胞。取在第24h后開始，每隔24h，每孔加入cc

17、k-8試劑10ul，孵育1.5h，在酶標(biāo)儀中以450nm吸光值，檢測其吸光度至72h。
　　3.3.5目標(biāo)蛋白對胃癌細(xì)胞株荷瘤小鼠瘤體的影響：
　　選用BLAB/C Nude小鼠，雌性20只，雄性20只，體重12-15g。選用MGC-803細(xì)胞株，充分傳代擴(kuò)增，取對數(shù)期細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，保證每只小鼠可以注射5x106個(gè)細(xì)胞（0.2ml）。注射細(xì)胞懸液0.2ml至裸鼠背部皮膚下。SPF級(jí)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，定期觀察瘤體生長情況，測

18、量裸鼠體重及瘤體大小，2周后分組給藥。用1ml生理鹽水溶解目標(biāo)蛋白10mg，保證濃度（10mg/ml）。每只裸鼠給藥劑量100mg/kg，給藥途徑選用尾靜脈注射。連續(xù)給藥5天，觀察裸鼠生命體征，瘤體大小及體重變化。1周后處死裸鼠，收集瘤體，稱重并測量瘤體大小，計(jì)算出抑制率。采用免疫組織化學(xué)方法檢測瘤體Ki67，Bcl-2和Bax的表達(dá)。
　　4、結(jié)果：
　　4.1胃癌血清蛋白標(biāo)記物的篩選結(jié)果
　　對測試組60例標(biāo)本的蛋

19、白質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過分析處理后得到特異性 m/z峰值（P<0.01）15個(gè)。其中在正常組呈低表達(dá)的為8個(gè)，呈高表達(dá)的7個(gè)。通過SVM進(jìn)行篩選Youden指數(shù)最高的組合模型得到了 m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白。m/z峰位于6438和14222的蛋白質(zhì)在正常組和術(shù)后組均呈高表達(dá)，在術(shù)前組則明顯低表達(dá)，m/z峰位于8622的蛋白在術(shù)前組呈高表達(dá)，在正常組和術(shù)后組呈低表達(dá)，聯(lián)合檢測此三種蛋白質(zhì)，利用leave-1-out交叉檢測，

20、它們對胃癌患者和正常對照血清組的敏感性是97.12％，特異性是95.27%。盲法測試結(jié)果顯示m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白模型用于區(qū)分胃癌和非胃癌患者血清標(biāo)本的敏感性為94.31%，特異性為93.68%，陽性預(yù)測值為95.12%。
　　4.2胃癌血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物純化及鑒定的結(jié)果
　　對含有m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化，將得到序列片段通過Mascot搜索軟件，與SwissPr

21、ot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行連接、比對、匹配，其分別屬于載脂蛋白C-I（apolipoprotein C-I，ApoC-I），轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（Transthyretin,TTHY），載脂蛋白C-Ⅲ（apolipoprotein C-Ⅲ，Apo C-Ⅲ）。
　　4.3胃癌血清差異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的驗(yàn)證結(jié)果
　　Western blot對胃癌患者術(shù)前組、術(shù)后組及正常對照組及的血清ApoC-I、TTHY和Apo C-III進(jìn)行測定。對三組血清中目

22、標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行條帶灰度值統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果為術(shù)前組與正常組蛋白質(zhì)灰度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05)，術(shù)前組與術(shù)后組蛋白質(zhì)灰度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)。
　　4.4類載脂蛋白C-I對胃癌細(xì)胞株影響
　　類載脂蛋白C-I對胃癌細(xì)胞株HGC27、MGC803的增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，并且根據(jù)給藥濃度和給藥時(shí)間的增加呈現(xiàn)正相關(guān)的增殖抑制作用。
　　4.5類載脂蛋白C-I對接種腫瘤細(xì)胞的荷瘤小鼠瘤體影響
　　類載脂

23、蛋白C-I對接種MGC803腫瘤細(xì)胞的荷瘤小鼠瘤體生長具有抑制作用，在對照組中腫瘤的重量為1.2+0.2g，而在實(shí)驗(yàn)組中腫瘤的重量為0.8+0.1g，抑制率為33.3%，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組中反應(yīng)增殖的指標(biāo)Ki67和Bcl-2表達(dá)量較對照組明顯降低，而反映促凋亡活性的Bax呈現(xiàn)高表達(dá)。
　　5、結(jié)論：
　　1.m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白質(zhì)經(jīng)過鑒定分別為Apo C-I、TTHY和A

24、po C-III，其表達(dá)強(qiáng)度變化與胃癌腫瘤負(fù)荷存在明顯相關(guān)性，為后期研究特異性蛋白標(biāo)記物與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供了新的思路。
　　2.聯(lián)合檢測Apo C-I、TTHY和Apo C-III三種蛋白質(zhì)可有效區(qū)分胃癌和非癌患者，對胃癌的血清學(xué)診斷具有一定的價(jià)值和應(yīng)用前景。
　　3.類載脂蛋白 C-I對胃癌細(xì)胞株和胃癌細(xì)胞株荷瘤小鼠瘤體具有抑制作用，對后期研究兩者的內(nèi)在聯(lián)系提供理論基礎(chǔ)。
　　4.類載脂蛋白C-I有可能作為一