miR-495調(diào)節(jié)TSPAN12在小細(xì)胞肺癌耐藥和增殖中的作用研究.pdf

1、目的：
　　通過篩選小細(xì)胞肺癌耐藥株(H69AR)和化療敏感株(H69)中具有差異表達(dá)的基因，選擇表達(dá)顯著上調(diào)的基因TSPAN12進(jìn)行研究，分析其對癌細(xì)胞增殖和藥物敏感性的影響及調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步豐富小細(xì)胞肺癌多藥耐藥的分子機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　內(nèi)容：
　　1.分析小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞H69AR和敏感株H69中TSPAN12基因表達(dá)的差異性，并取另一對細(xì)胞H446/CDDP和H446進(jìn)行驗(yàn)證;
　　2.

2、分析TSPAN12對SCLC癌細(xì)胞藥物敏感性和增殖的影響;
　　3.分析SCLC耐藥細(xì)胞H69AR和敏感株H69中miR-495的表達(dá)差異性及其對TSPAN12的調(diào)節(jié)作用;
　　4.分析TSPAN12對β-catenin信號通路活化的影響。
　　研究方法:
　　1.cDNA基因芯片分析SCLC多藥耐藥細(xì)胞H69AR和敏感株H69中具有差異表達(dá)的基因，選擇tetraspanin家族中表達(dá)顯著差異的TSPAN12，通

3、過實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)和western blotting技術(shù)驗(yàn)證TSPAN12在兩株細(xì)胞中mRNA和蛋白水平上的表達(dá)差異;取另一對細(xì)胞(H446/CDDP、H446)共同驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果。
　　2.利用shRNA降低SCLC耐藥株H69AR和H446/CDDP中TSPAN12表達(dá)水平，CCK-8法分析癌細(xì)胞對小細(xì)胞肺癌常用化療藥物順鉑(Cisplatin，DDP)和足葉乙甙(Etoposide，VP-16)的敏感

4、性變化;分別利用CCK-8法和平板克隆實(shí)驗(yàn)分析下調(diào)TSPAN12表達(dá)后H446/CDDP細(xì)胞的增殖變化;流式細(xì)胞術(shù)分析shRNA轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡和周期的變化。
　　3.利用miRNA芯片技術(shù)分析SCLC耐藥細(xì)胞H69AR和敏感株H69中差異表達(dá)的microRNA，通過生物信息學(xué)軟件（microRNA.org）分析TSPAN12相關(guān) miRNA，選擇表達(dá)差異顯著的miR-495進(jìn)行研究，通過qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證H69AR、H446

5、/CDDP及其相應(yīng)親本中miR-495的表達(dá)差異性。
　　4.通過構(gòu)建miR-495 mimics和miR-495 inhibitors增加或抑制耐藥株(H69AR、H446/CDDP)及其親本細(xì)胞中miR-495的表達(dá)水平，利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，然后分別利用qRT-PCR和western blotting技術(shù)在mRNA和蛋白水平檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中TSPAN12基因表達(dá)的情況。
　　5.利用qRT-PCR和wes

6、tern blotting技術(shù)分析下調(diào)TSPAN12后SCLC細(xì)胞H446/CDDP中β-catenin在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)變化;通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析下調(diào)TSPAN12前后細(xì)胞中β-catenin的分布情況。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)。各實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。耐藥株及其親本間TSPAN12或miR-495表達(dá)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間細(xì)

7、胞周期或凋亡比較采用one-way ANOVA（方差齊同時）或Welch法（方差不齊時），多重比較采用Dunnett法（方差齊同時）或Dunnett's T3法（方差不齊時）。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，多重比較采用SNK法。以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.cDNA芯片結(jié)果顯示TSPAN12在SCLC耐藥株H69AR中的表達(dá)是敏感株H69中的3.15倍，qRT-PCR結(jié)果（4.66倍，

8、P=0.033）和western blotting結(jié)果（1.50倍，P=0.01）;在H446/CDDP和H446細(xì)胞中qRT-PCR結(jié)果(2.15倍，P=0.028)和westem blotting檢測（1.77倍，P＜0.001），驗(yàn)證了基因芯片的結(jié)果。
　　2.設(shè)計(jì)針對TSPAN12的shRNA寡核苷酸，利用lipofectamin2000轉(zhuǎn)染H446/CDDP細(xì)胞，提取總RNA和總蛋白，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TSP

9、AN12-1082和TSPAN12-748后細(xì)胞中TSPAN12 mRNA水平分別下降至原來的28.6667％(P＜0.001)和65.333％(P=0.019)，結(jié)果與western blotting的一致，選取轉(zhuǎn)染TSPAN12-1082進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.CCK-8法分析癌細(xì)胞藥物敏感性結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染TSPAN12-1082后H69AR和H446/CDDP對化療藥物（順鉑和足葉乙甙）的生存率下降，IC50值亦相應(yīng)減小，但

10、P＞0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染TSPAN12-1082后H446/CDDP細(xì)胞在不同時間點(diǎn)生存率的變化，結(jié)果顯示TS PAN12下調(diào)后H446/CDDP細(xì)胞增殖速率顯著減慢(P＜0.05);進(jìn)一步通過平板克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，顯示TSPAN12下調(diào)后細(xì)胞形成克隆能力顯著下降（P=0.022）。
　　5.利用流式細(xì)胞術(shù)對轉(zhuǎn)染TSPAN12-1082后H446/CDDP細(xì)胞周期的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSPAN

11、12下調(diào)可引起細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯(P=0.01);在細(xì)胞凋亡方面，下調(diào)TSPAN12可促進(jìn)藥物對細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡(P=0.002)。
　　6.利用miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)SCLC多藥耐藥株H69AR中miR-495較敏感株H69中的明顯下調(diào)（后者約為前者的4.51倍），qRT-PCR結(jié)果(0.32667倍，P=0.017)，取H446/CDDP和H446細(xì)胞共同驗(yàn)證，qRT-PCR結(jié)果(0.24667倍，P=0.016)，芯片結(jié)

12、果得以驗(yàn)證。
　　7.利用microRNA靶基因預(yù)測軟件檢測發(fā)現(xiàn)miR-495的基因序列能與TSPAN12mRNA的3'-UTR部分互補(bǔ)配對，轉(zhuǎn)染miR-495mimics后H69AR細(xì)胞中miR-495表達(dá)上調(diào)3.31倍(P=0.018)，qRT-PCR示TSPAN12下調(diào)至其親本的0.67倍(P=0.045)，蛋白水平上TSPAN12下調(diào)0.57倍(P＜0.001);而轉(zhuǎn)染miR-495 inhibitors后H69細(xì)胞中mi

13、R-495表達(dá)下調(diào)至0.42倍(P=0.017)，TSPAN12在mRNA水平上增加4.76倍(P=0.018)，蛋白水平上增加2.58倍(P＜0.001);在H446/CDDP和H446細(xì)胞中重復(fù)相同實(shí)驗(yàn)也得到類似結(jié)果。
　　8.H446/CDDP轉(zhuǎn)染TSPAN12-1082后，通過qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示中β-catenin及其下游基因MYC和CyclinD1表達(dá)分別下調(diào)0.47倍、0.48倍及0.38倍(P＜0.05)，

14、western blotting結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TSPAN12后β-catenin下調(diào)0.72倍(P＜0.05);在H69和H69AR細(xì)胞中重復(fù)相同實(shí)驗(yàn)得到一致的結(jié)果。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示TSPAN12下調(diào)后細(xì)胞核內(nèi)分布的β-catenin蛋白減少。
　　結(jié)論:
　　1.TSPAN12在SCLC多藥耐藥細(xì)胞H69AR中表達(dá)上調(diào)，降低細(xì)胞中TSPAN12的表達(dá)可以增加癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性并抑制癌細(xì)胞增殖，提示TSPAN12可能是小

15、細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的一個促癌因子，但不是調(diào)節(jié)小細(xì)胞肺癌耐藥的關(guān)鍵因素。
　　2.TSPAN12可以影響SCLC癌細(xì)胞周期及其對化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　3.miR-495在SCLC多藥耐藥細(xì)胞H69AR中表達(dá)下調(diào)，降低或增加miR-495可以下調(diào)或上調(diào)TSPAN12的表達(dá)，提示TSPAN12可能是miR-495的靶基因。
　　4.降低TSPAN12在癌細(xì)胞中的表達(dá)可以下調(diào)β-catenin及其下游基因的表達(dá)，并抑制β