釀酒酵母Iml3-Chl4復合物的結構生物學研究以及膜蛋白NPC1的表達純化.pdf

1、遺傳物質的準確復制并精確分配到子代細胞中是生物體存活與延續(xù)的基礎。根據細胞分裂類型又可分為有絲分裂和減數分裂。但無論哪種細胞分裂，都需要紡錘體的紡錘絲附著在染色體的特定區(qū)域上，最終牽引染色體被拉向細胞的兩極。人們把這個特定的區(qū)域稱之為著絲粒，大分子復合物——動粒在著絲粒上進行組裝，指導染色體的分離。
　　根據在動粒上的位置，可將動粒組分分為內層動粒蛋白、外層動粒蛋白以及調節(jié)蛋白。目前一致認為內層動粒主要由16個CCAN蛋白（哺乳動

2、物類）組分組成，該區(qū)域與著絲粒DNA緊密連接，隨后招募其他的動粒組分。而CENP-L/CENP-N作為CCAN復合物的核心組成元件，在動粒組裝的上游發(fā)揮作用，并招募其他組分在染色體上裝配。但CENP-L/CENP-N是如何被招募到著絲粒核小體上目前還不是很透徹。
　　本文以釀酒酵母著絲粒動粒蛋白Iml3/Chl4（哺乳動物CENP-L/CENP-N的同源蛋白）為研究對象，解析了Iml3蛋白和Iml3-Chl4378-458復合物的

3、晶體結構。結構顯示:Iml3是一個較新的結構組裝模式，主要由兩個分離的結構域組成:不完全的β折疊桶和扭曲的平面，通過分子間的疏水作用維持著整個結構的穩(wěn)定性。在晶體結構中，盡管一個不對稱單位中只有一個Iml3分子，但它與晶體學對稱所產生的另一個Iml3分子通過βstrand上的主鏈氫鍵形成同源二聚體。當Chl4蛋白存在時，Chl4能破壞Iml3的同源二聚界面，以更加穩(wěn)定的方式結合Iml3。Chl4的C端形成4個βstrands，以反平行的

4、方式與Iml3的11個βstrands組成一個連續(xù)、延伸的β-sheet，并通過多對氫鍵以及鹽橋相互作用保證了復合物的穩(wěn)定和結合特異性。
　　結構分析與文獻查閱發(fā)現，Chl4通過與著絲粒Cse4核小體（哺乳動物CENP-A核小體）的直接相互作用被招募，除了Chl4的N端與Mif2蛋白（哺乳動物CENP-C的同源蛋白，具有DNA結合能力）相互作用的推動，是否還存在其他的作用力促使這個過程的發(fā)生呢？凝膠阻滯和熒光偏振實驗結果表明，Im

5、l3和Chl4具有協同結合dsDNA的能力，而單獨的Iml3和Chl4都不具有與dsDNA的結合能力。結構分析及突變體實驗發(fā)現，這種非特異性結合dsDNA的能力主要來源于Iml3-Chl4復合物的β-sheet內側堿性富集區(qū)。與幾乎同時發(fā)表的的Stephen et al.研究組的研究表明:破壞Iml3與Chl4的二聚作用界面，直接導致了染色體分離的準確性以及使孢子的生成率降低，他們將此現象的最終原因歸結為異源二聚界面的破壞。我們的凝膠阻

6、滯以及熒光偏振等實驗表明，異源二聚界面的破壞只是表象，二聚界面的破壞導致了Iml3-Chl4復合物上的β-sheet內層表面的堿性殘基富集區(qū)被破壞，從而失去了dsDNA的結合能力，這可能直接阻礙了自身的著絲粒定位以及其下游內層動粒蛋白的招募，從而抑制了動粒的組裝，最終影響了染色體的分離。
　　膽固醇作為一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，廣泛存在于動物的腦及神經組織中，為哺乳動物生長發(fā)育所必須，同時也是細胞膜結構的重要組成部分。但是作為兩性

7、分子，膽固醇的轉運以及信號傳導既需要可溶蛋白的協助，又需要膜蛋白的參與。
　　在哺乳動物中，膽固醇除了內質網上的從頭合成，還涉及到外源性攝取:低密度脂蛋白結合到低密度脂蛋白受體上，隨后內化進早期內涵體，在酸性pH的作用下，兩者解離。低密度脂蛋白被轉運至晚期內涵體，經溶酶體酶水解成自由膽固醇，在可溶蛋白NPC2/膜蛋白NPC1的協同作用下，轉運出內涵體。當NPC2/NPC1基因發(fā)生突變時，會引起自由膽固醇在內涵體中的積累，在人源中這

8、種疾病稱為Niemann-Pick type C(NPC)疾病?？梢钥闯觯さ鞍譔PC1是一種非常重要的轉運蛋白。近來研究發(fā)現，NPC1還可以作為某些包膜絲狀病毒感染宿主細胞的受體蛋白，幫助絲狀病毒在宿主細胞內的復制、組裝。但膜蛋白NPC1是如何既作為轉運蛋白幫助膽固醇的轉運，又作為受體蛋白幫助子代病毒感染宿主細胞還不是很透徹。
　　本文以膜蛋白NPC1為研究對象，成功克隆了NPC1蛋白在不同物種中的50個同源蛋白，篩選出了能在p