22例戈謝病患者GBA基因突變分析及新突變的功能學(xué)研究.pdf

1、背景：
　　戈謝?。℅aucher Disease，OMIM606463）是一種相對常見的溶酶體貯積病，呈常染色體隱性遺傳。是由于GBA基因發(fā)生突變引起溶酶體內(nèi)β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，GBA，EC3.2.1.45）活性顯著降低或缺乏而致病。β-葡萄糖苷酶的作用是將底物葡萄糖腦苷脂水解成葡萄糖和神經(jīng)酰胺，當該酶活性降低或缺乏時，大量的底物沉積于溶酶體內(nèi)，造成多器官的損傷，主要表現(xiàn)為肝脾腫大、骨病和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。戈

2、謝病的臨床表現(xiàn)輕重差異較大，輕者可無癥狀，重者可在圍產(chǎn)期致死。根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)是否受累，戈謝病的臨床表型可分為3種：I型（非神經(jīng)型/慢性型）、II型（急性神經(jīng)型/神經(jīng)型）、III型（亞急性神經(jīng)型/神經(jīng)型）。在猶太人群戈謝病患者中，I型最為常見，各個年齡段均可發(fā)病，多在學(xué)齡前兒童發(fā)病，沒有神經(jīng)系統(tǒng)受累的表現(xiàn)；II型戈謝病常在嬰兒期發(fā)病，病情嚴重，可表現(xiàn)為迅速進展的癲癇發(fā)作、角弓反張等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，可在2歲前死亡；III型戈謝病早期表現(xiàn)為臟器的

3、損傷，后逐漸出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。戈謝病在世界各地均有發(fā)病，但其發(fā)病率具有明顯的種族差異性。據(jù)估計，戈謝病在普通人群中的發(fā)病率為1/50,000-1/100,000，在猶太人群中的發(fā)病率最高，為1/500-1/1,000。
　　外周血白細胞或培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞GBA酶活性的檢測是診斷戈謝病的金標準。當外周血白細胞或皮膚成纖維細胞中GBA酶活性明顯降低至正常均值的30％以下時，即可診斷為戈謝病。隨著檢測技術(shù)的提高，以干血片為載體的GB

4、A酶學(xué)測定在戈謝病的篩查及診斷中逐漸普及應(yīng)用，為新生兒及高危戈謝病患者的篩查提供基礎(chǔ)。此外，GBA基因突變分析可從分子水平進一步確診戈謝病。
　　GBA基因跨度7.6kb，位于1q21，有11個外顯子，10個內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄一條長2387bp的mRNA，開放閱讀框為1611bp，編碼536個氨基酸的多肽鏈。在同一染色體距 GBA基因下游16kb的位置，存在一個跨度5.5kb，同源性達96%的假基因（GBAP），真假基因可發(fā)生同源重組導(dǎo)

5、致致病突變產(chǎn)生。根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫HGMD（Professional2016.2）報道，GBA基因突變共437種，包括點突變、剪接突變、小缺失小插入突變、基因重排，其中以點突變最常見，約占75.7%。GBA基因的突變譜存在種族及地域的差異，在猶太人群及高加索人群戈謝病患者中，N370S、84GG、L444P、IVS2+1G>A這4種突變最為常見，分別占戈謝病患者GBA基因突變的97%及75%。而在亞洲人群戈謝病患者中，L444P、F

6、213I、RecNciI這3種突變最為常見。
　　戈謝病臨床表型與基因型間的關(guān)系尚未十分明確。N370S和N188S突變與I型戈謝病有關(guān)，L444P/RecNciI基因型與II型戈謝病有關(guān)，L444P純合型突變與III型戈謝病有關(guān)。戈謝病臨床表型與基因型間的關(guān)系的研究，可為患者的疾病預(yù)后評估、治療和遺傳咨詢提供幫助。
　　戈謝病的特異性治療方法有酶替代療法、底物減少療法、分子伴侶治療法、造血干細胞移植治療、基因治療。酶替代治

7、療是臨床采用的主要治療方法。目前，在我國上市的藥品是注射用的伊米苷酶（Imiglucerase），酶替代治療能顯著改善患者的臨床癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，只對未涉及神經(jīng)病變的I型戈謝病有效，但不能預(yù)防或改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，且治療費用昂貴，普及率不高；底物減少法治療在美國已經(jīng)批準上市的藥物有美格魯特（Miglustat, Zavesca），它是一種對I型戈謝病患者有效的口服藥，雖然可透過血腦屏障，但臨床上并沒有觀察到它對II型及III型

8、戈謝病患者有效；近幾年學(xué)者對分子伴侶治療方法的研究較多，研究發(fā)現(xiàn)分子伴侶藥物不僅能有效改善患者的臨床癥狀，而且對神經(jīng)系統(tǒng)癥狀有改善作用，因為該藥物可以穿過血腦屏障，是目前解決戈謝病神經(jīng)組織病變問題最有前景的治療方法。研究表明，針對不同的突變，分子伴侶藥物的治療效果不同，如脫氧野尻霉素類藥物可使N370S突變的GBA酶活性提高至6.2倍，而IFG類藥物可使L444P突變的GBA酶活性提高至3.5倍。因此，尋找針對不同突變的最合適的分子伴侶

9、藥物是目前戈謝病藥物治療研究的突破點。造血干細胞移植治療風險較大，國際上對該治療方法報道極少。基因治療仍在動物研究階段。
　　對于戈謝病GBA基因突變特點的了解，多數(shù)來自于歐洲和美國等國外學(xué)者的文獻報道，除韓國和日本學(xué)者對戈謝病GBA基因突變特點進行了報道，其它亞洲地區(qū)的國家對戈謝病的研究報道較少，我國對戈謝病的相關(guān)研究也非常缺乏。自1985年Sorge等成功克隆出人類GBA基因cDNA片段以來，科學(xué)家不斷深入探索了 GBA基因突

10、變對蛋白酶結(jié)構(gòu)和功能的改變及突變蛋白加工修飾過程中的異常。我國對戈謝病的分子發(fā)病致病機制的研究較晚，新突變的功能學(xué)驗證資料更是少見。因此，分析戈謝病患者GBA基因突變特點，對新突變致病性進行功能學(xué)驗證，探討戈謝病患者臨床表型與基因型間的關(guān)系是十分有意義的。
　　目的：
　　分析22例中國戈謝病患者GBA基因的突變特點，對GBA基因新突變進行體外功能學(xué)鑒定，并探討戈謝病臨床表型與基因型間的關(guān)系。
　　方法：
　　2

11、010年1月至2015年12月廣州市婦女兒童醫(yī)療中心內(nèi)分泌與遺傳代謝科根據(jù)外周血白細胞GBA酶活性檢測確診戈謝病患兒共22例，來自中國南方地區(qū)（廣東省、湖南省、江西省、貴州?。?，均無血緣關(guān)系，其中男15例，女7例。提取患者外周血基因組DNA，采用巢式PCR的方法對GBA基因的11個外顯子及外顯子兩端的側(cè)翼序列進行基因突變分析，對新突變進行多物種突變氨基酸的保守性分析，并利用 SIFT及 Polyphen-2軟件預(yù)測新突變的致病性，利用人

12、GBA蛋白晶體結(jié)構(gòu)同源建模，使用PyMOL及Discovery Studio軟件標記突變位點在蛋白三維結(jié)構(gòu)中的位置及分析其對蛋白結(jié)構(gòu)的影響。建立GBA基因體外真核表達體系，把pcDNA3.1-EGFP作為空載體，構(gòu)建pcDNA3.1-GBA-EGFP野生型載體，然后再體外定點誘變成相應(yīng)的突變型載體，轉(zhuǎn)染COS-7細胞后提取細胞總蛋白，采用熒光法對GBA酶活性及參考酶β-半乳糖苷酶活性進行檢測，并進行Western blot蛋白印跡分析，

13、對新突變進行功能學(xué)驗證。通過結(jié)合基因突變特點及患者臨床信息，探討戈謝病患者臨床表型與基因型間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.本研究22例戈謝病患者的診斷年齡5個月-69歲，<3歲的患者占63.6%（13/22）?；颊叩耐庵苎准毎鸊BA酶活性明顯降低，為2.05±1.49 nmol/mg/h，除4例戈謝病患者的殼三糖苷酶活性為0 nmol/ml/h，其余患者的殼三糖苷酶活性均顯著升高，為5916.93±4635.75 nmol

14、/mg/h。22例戈謝病患者中，I型19例，II型3例，沒有發(fā)現(xiàn)III型患者。I型患者中，63%（12/19）的患者在2歲內(nèi)起病，且表現(xiàn)為嚴重的脾大，貧血、血小板降低等，26%（5/19）的患者3歲前死亡。II型患者均在嬰兒期發(fā)病，2歲前死亡。本研究有6例基因型為L444P/L444P的I型患者，早期發(fā)病，病情嚴重；有9例基因型為L444P復(fù)合雜合型的I型患者，其臨床表現(xiàn)存在輕重差異；有2例基因型均為L444P/RecNciI患者，臨床

15、分型均為II型。
　　2.本研究的44個GBA等位基因均檢測出（檢出率為100%），共檢出18種不同的突變，包括14種已知致病突變（F37V、L96P、R120W、M123V、L264I、R359Q、Y363C、V375L、D409H、L444P、R496C、RecNciI、IVS2+1G>A、IVS6-1G>C）和4種新突變（Y22C、F109L、L149F、c.983_990delCCCACTGG）。突變L444P最常見，突變

16、率為47.7%，其次為RecNciI(6.8%)。新錯義突變Y22C、F109L、L149F及功能未知的已報道突變L96P的突變氨基酸在12個不同物種中高度保守，且SIFT評分均接近0，Polyphen-2評分均接近1。GBA蛋白結(jié)構(gòu)分析提示 Y22C突變可使糖基化位點 N19附近的蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；L96P、F109L、L149F突變位點均位于催化區(qū)域，可影響蛋白催化結(jié)構(gòu)的形成。
　　3.空載體、野生型及突變型載體轉(zhuǎn)染COS

17、-7細胞72小時后，熒光顯微鏡觀察可見各組細胞均顯示明亮綠色熒光，Y22C、L96P、F109L、L149F突變型載體表達GBA酶活性明顯降低。Western blot蛋白印跡分析結(jié)果提示，Y22C、L96P、F109L、L149F突變型載體GBA蛋白表達量均有不同程度的減少。
　　結(jié)論：
　　1.本研究豐富了GBA基因的突變譜。通過GBA基因分析，本研究共檢測出18種不同的突變，其中有4種新突變（Y22C、F109L、L1

18、49F、c.983_990delCCCACTGG）。L444P為熱點突變，突變率為47.7%，其次為RecNciI(6.8%)。
　　2.構(gòu)建了GBA基因體外真核表達載體，經(jīng)COS-7細胞瞬時表達實驗驗證，新突變Y22C、F109L、L149F為致病性突變，同時為新突變功能學(xué)研究及分子致病機制提供基礎(chǔ)。
　　3.本研究發(fā)現(xiàn)L444P純合型患者與重癥的I型戈謝病有關(guān)。L444P復(fù)合雜合型患者臨床癥狀的嚴重程度常與其攜帶的另一個