多發(fā)性腦梗死氣虛血瘀證大鼠模型的建立及其相關(guān)生物學(xué)指標變化研究.pdf

1、研究背景
　　中風又稱腦卒中，它是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一。調(diào)查研究顯示，在我國每年腦卒中發(fā)病新增人數(shù)約250萬，且呈逐年遞增趨勢。每年腦卒中致死人數(shù)占總死亡人數(shù)的22.45％，嚴重威脅人類健康，影響人們生活水平，并且給社會和家庭造成沉重的經(jīng)濟負擔。在腦卒中病理分型中，腦梗死約占總發(fā)病人數(shù)的四分之三;在中風中醫(yī)辨證證型中，氣虛血瘀證最為常見。所以在進行腦血管疾病研究時應(yīng)加強注重對腦梗死氣虛血瘀證的研究。
　　疾病動

2、物模型的建立是疾病研究和中藥新藥研發(fā)的一個重要手段。目前，研究中常采用多因素疊加的方法來建立腦梗死氣虛血瘀證病證結(jié)合大鼠模型，雖然取得了一些進展，但因建模方法和評價體系缺少規(guī)范化和標準化，且干擾因素復(fù)雜導(dǎo)致致病機理不容易闡明，與自然發(fā)病狀態(tài)還有一定的差距，所以往往難以得到公認。因此本課題以多發(fā)性腦梗死氣虛血瘀證大鼠模型為研究對象，在之前研究者研究成果的基礎(chǔ)上進行改進并比較，嘗試得出一種穩(wěn)定的造模方法，并對模型評價體系進行補充和完善，同時

3、結(jié)合本所承擔的“973”課題的研究目標和內(nèi)容，對此模型形成過程中機體內(nèi)與氣血相關(guān)的生物學(xué)指標的變化進行研究，為中藥新藥的研發(fā)和中藥復(fù)方功效的闡述提供有價值的研究模型和手段。
　　第一部分多發(fā)性腦梗死氣虛血瘀證大鼠模型建立方法研究
　　1.研究目的
　　依據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論，采用不同造模因素探討多發(fā)性腦梗死氣虛血瘀證病證結(jié)合大鼠模型的建立方法。
　　2.材料和方法
　　將SD雄性大鼠隨機分為5組:A.正常組:正常

4、飲食、飲水5周，n=11;B.假手術(shù)組:僅切口、穿線，不注射熒光微球，其他同正常組，n=11;C.單純睡眠剝奪組（睡奪組）:每天睡眠剝奪16h（每天16點至次日8點），共剝奪5周，n=11;D.單純多發(fā)性腦梗死組（腦梗組）:于正常飼養(yǎng)1周后行多發(fā)性腦梗死手術(shù)，術(shù)后繼續(xù)正常飼養(yǎng)4周，n=12;E.睡眠剝奪復(fù)合多發(fā)性腦梗死組（睡奪+腦梗組）:每天睡眠剝奪16h（每天16點至次日8點），睡眠剝奪1周后行多發(fā)性腦梗死手術(shù)，術(shù)后繼續(xù)睡眠剝奪4周，

5、n=12。術(shù)后4周（睡眠剝奪5周）觀察大鼠一般表征狀態(tài)，分別采集大鼠體重，抓力，負重力竭游泳時間，自發(fā)活動路程，脈搏幅度等氣虛指標;分別采集和測定大鼠舌而圖像R、G、B值，血液流變學(xué)，凝血四項等血瘀指標;分別采集大鼠神經(jīng)功能缺損情況評分（分別于術(shù)后24h和術(shù)后4周后各采集一次），大鼠腦表面熒光微球分布情況圖片，腦切片梗死區(qū)域分布情況圖片（于術(shù)后24h采集），腦組織病理及超微結(jié)構(gòu)觀察等多發(fā)性腦梗死疾病指標;測定腦組織勻漿液中MDA含量以及

6、SOD、Na+-k+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性等指標。
　　3.研究結(jié)果
　　(1)一般狀態(tài)觀察:正常組和假手術(shù)組大鼠一般狀態(tài)良好，三個模型組大鼠均出現(xiàn)一定程度的懶動，精神萎靡的現(xiàn)象，其中睡奪+腦梗組較其它兩個模型組情況更嚴重。(2)氣虛指標:與假手術(shù)組比較，三個模型組體重、負重力竭游泳時間、自發(fā)活動路程、抓力和脈搏幅度均有不同程度減少（P＜0.05或P＜0.01）或有下降趨勢（腦梗組體重）;與睡奪組和腦梗組比較，睡

7、奪+腦梗組體重、負重力竭游泳時間、自發(fā)活動路程、抓力和脈搏幅度均顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）。(3)血瘀指標:①舌面圖像R、G、B值:與假手術(shù)組比較，三個模型組舌面圖像R、G、B值均顯著減少(P＜0.01);與睡奪組和腦梗組比較，睡奪+腦梗組大鼠舌面圖像R、G、B值均顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）。②血液流變學(xué):與假手術(shù)組比較，三個模型組在切變率5 s-1下的全血黏度均明顯增加(P＜0.05)，睡奪+腦梗組在切變率60

8、s-1下的全血黏度明顯增加(P＜0.05);三個模型組之間在各切變率下的全血黏度無明顯差異。③凝血四項:與假手術(shù)組比較，睡奪組TT明顯減少(P＜0.05)，腦梗組和睡奪+腦梗組PT、APTT、TT均明顯減少(P＜0.05或P＜0.01);與睡奪組和腦梗組比較，睡奪+腦梗組PT明顯減少(P＜0.05)。(4)腦梗死疾病指標:①神經(jīng)功能缺損情況評分:術(shù)后24h和術(shù)后4周，腦梗組和睡奪+腦梗組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損情況，術(shù)后24h，兩組神經(jīng)功

9、能缺損情況評分無顯著差異;術(shù)后4周，睡奪+腦梗組神經(jīng)功能缺損情況評分顯著高于腦梗組(P＜0.01)。②腦表觀與腦切片TTC染色觀察:術(shù)后4周腦梗組和睡奪+腦梗組大腦均出現(xiàn)熒光微球散狀分布，且局部出現(xiàn)壞死區(qū)域;術(shù)后24h大腦切片右半腦均有面積不等的白色梗死區(qū)域。③腦組織病理及超微結(jié)構(gòu)觀察:通過腦組織HE染色和電鏡觀察可見，正常組和假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常，睡奪組腦組織結(jié)構(gòu)基本正常，腦梗組和睡奪+腦梗組腦組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病理性改變。
　

10、　(5)生化指標:與假手術(shù)組比較，三個模型組腦皮層MDA含量均顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)，SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);與睡奪組和腦梗組比較，睡奪+腦梗組大鼠腦皮層MDA含量明顯增加(P＜0.05)，SOD、Na-+K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
　　4.結(jié)論
　　單純證候造模，即長時間睡眠剝奪可以

11、使大鼠出現(xiàn)氣虛血瘀證候表現(xiàn)，但尚不能達到腦梗死疾病病理改變;而單純疾病造模，則主要反映臨床病理變化，缺少與中醫(yī)理論的關(guān)聯(lián)，尚不能完整體現(xiàn)中醫(yī)證候特征或與特定的中醫(yī)證候等同;采用復(fù)合因素（睡眠剝奪+腦梗死）建立的模型綜合了兩者的技術(shù)優(yōu)勢，與中醫(yī)理論緊密關(guān)聯(lián)，與病證結(jié)合動物模型的特征相符合，與臨床疾病發(fā)生發(fā)展的過程更接近，能夠完整體現(xiàn)中醫(yī)證候特征，有助于闡釋中醫(yī)證候的科學(xué)內(nèi)涵和理論基礎(chǔ)。上述氣虛、血瘀、疾病、能量代謝、病理觀察等多項指標結(jié)果

12、的綜合分析，也證明復(fù)合因素（睡眠剝奪+腦梗死）造模優(yōu)于單純疾病造模和單純證候造模，是一種穩(wěn)定、可控且重復(fù)性較好的多發(fā)性腦梗死氣虛血瘀證病證結(jié)合大鼠模型。
　　第二部分多發(fā)性腦梗死氣虛血瘀證大鼠模型病理生理演化過程及益氣活血方干預(yù)的研究
　　1.研究目的
　　觀察采用復(fù)合因素建立的病證結(jié)合模型在不同時間點各指標的變化，研究模型病理生理演化過程，并用益氣活血方進行干預(yù)，探討模型建立方法的穩(wěn)定性和可靠性。
　　2.材料

13、和方法
　　將雄性SD大鼠隨機分為4組，分別為正常組，假手術(shù)組，睡眠剝奪復(fù)合多發(fā)性腦梗死模型組，益氣活血方組。正常組:正常飲食、飲水，同時與假手術(shù)組同步按照10ml/kg灌胃蒸餾水，每天1次，連續(xù)4周，n=31;假手術(shù)組:僅切口、穿線，不注射熒光微球，術(shù)后開始灌胃蒸餾水，其他同正常組，n=31;睡眠剝奪復(fù)合多發(fā)性腦梗死組（睡奪+腦梗組）:每天睡眠剝奪16h（每天16點至次日8點），睡眠剝奪1周后行多發(fā)性腦梗死手術(shù)，術(shù)后繼續(xù)睡眠剝奪

14、4周，并于術(shù)后開始每天按照10ml/kg灌胃蒸餾水，每天1次，連續(xù)4周，n-30;益氣活血方組:每天睡眠剝奪16h（每天16點至次日8點），1周后行多發(fā)性腦梗死手術(shù)，術(shù)后繼續(xù)睡眠剝奪4周，并于術(shù)后開始每天按照10ml/kg灌胃益氣活血方（26g生藥/kg）1次，連續(xù)給藥4w，n=30。術(shù)后分三個時間點（術(shù)后48h、術(shù)后2周、術(shù)后4周）從每組隨機選取10只大鼠進行相關(guān)指標測定。每階段造模結(jié)束后檢測指標和方法同第一部分實驗，新增LD、LDH

15、、TXB2、6-keto-PGF1α、5-HT五項指標測定。
　　3.研究結(jié)果:
　　(1)一般狀態(tài)觀察:正常組和假手術(shù)組大鼠三個時間點的一般狀態(tài)良好，模型組和益氣活血方組大鼠三個時間點均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，懶動的狀態(tài)，模型組大鼠隨造模時間延長情況愈加嚴重，益氣活血方組大鼠一般狀態(tài)較模型組有明顯改善。(2)氣虛指標:與假手術(shù)組比較，模型組體重、抓力、負重力竭游泳時間、自發(fā)活動路程、脈搏幅度均顯著減少(P＜0.01);與模

16、型組比較，益氣活血方組術(shù)后4周體重、抓力、負重力竭游泳時間、自發(fā)活動路程、脈搏幅度均顯著上升（P＜0.05或P＜0.01）。(3)血瘀指標:①舌面圖像R、G、B值:與假手術(shù)組比較，模型組三個時間點舌面圖像R、G、B值均顯著減少(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，益氣活血方組術(shù)后48h舌面圖像RG、B值均無明顯差異，術(shù)后2周舌面圖像R值顯著增加(P＜0.01)，G、B值無明顯差異，術(shù)后4周舌面圖像R、G、B值均顯著增加(P＜0.

17、05)。②血液流變學(xué)指標:與假手術(shù)組比較，模型組三個時間點在切變率5 s-1、60 s-1、150 s-1下的全血黏度均明顯增加(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，益氣活血方組術(shù)后2周在切變率5 s-1、60 s-1下的全血黏度均顯著降低(P＜0.01)，術(shù)后4周在切變率5 s-1下的全血黏度明顯降低(P＜0.05)。③凝血四項指標:與假手術(shù)組比較，模型組術(shù)后2周、4周PT、APTT、TT均明顯減少（P＜0.05或P＜0.01

18、）;與模型組比較，益氣活血方組術(shù)后2周、4周PT、TT均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。(4)腦梗死疾病病理指標:①神經(jīng)功能缺損情況評分:模型組三個時間點均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損情況;與模型組比較，益氣活血方組術(shù)后48h和術(shù)后2w神經(jīng)功能缺損評分無明顯差異，術(shù)后4w神經(jīng)功能缺損情況評分有減少趨勢。②腦表觀與腦切片TTC染色觀察:模型組和益氣活血方組大鼠右半腦三個時間點均出現(xiàn)熒光微球散狀分布，且有局部壞死，早期有水腫區(qū)域，益氣活血方組水

19、腫、壞死程度輕于模型組;③腦組織病理及超微結(jié)構(gòu)觀察:通過腦組織HE染色和電鏡觀察可見，正常組和假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常，模型組腦組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的病理性改變，且隨著造模時間延長不斷加重，益氣活血方組腦組織結(jié)構(gòu)病變較模型組明顯減輕。(5)生化指標測定:與假手術(shù)組比較，模型組三個時間點腦皮層SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），LDH活性明顯升高(P＜0.01)，腦皮層MDA、LD、血

20、清TXB2含量均明顯增加(P＜0.01)，血清6-keto-PGF1α、腦皮層5-HT含量均明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）;與模型組比較，益氣活血方組術(shù)后2周5-HT含量明顯增加(P＜0.05)，術(shù)后4周Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性均明顯升高(P＜0.05)，LDH活性明顯降低(P＜0.01)，LD、MDA、TXB2含量均明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），6-keto-PGF1α和5-HT含量均明顯增加(

21、P＜0.05)。
　　4.結(jié)論
　　(1)采用睡眠剝奪復(fù)合腦梗死手術(shù)，建立多發(fā)性腦梗死氣虛血瘀證大鼠模型，觀察并分析了模型發(fā)展不同時間點各項指標的變化特點，初步揭示了模型氣虛血瘀證候的演化過程及相關(guān)生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　(2)益氣活血方對多發(fā)性腦梗死氣虛血瘀證大鼠模型有較好療效，主要體現(xiàn)在對模型大鼠的一般表征、氣虛血瘀狀態(tài)、能量代謝障礙、血液流變性、凝血功能、腦組織病理改變等方面均有較好的改善作用，驗證了所建立的病證結(jié)合模