重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的克隆、表達(dá)、純化和PEG單修飾以及修飾前后的體內(nèi)外生物學(xué)活性.pdf

1、目的：構(gòu)建、表達(dá)pJGW-2-G-CSF表達(dá)載體，表達(dá)產(chǎn)物G-CSF經(jīng)純化后經(jīng)PEG20k化學(xué)修飾，純化得到修飾產(chǎn)物PEG-G-CSF，測定修飾前后G-CSF體外和小鼠體內(nèi)的生物學(xué)活性。 方法：酶切回收目的G-CSF DNA片段，將目的基因插入pJGW-2中構(gòu)建成表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。鑒定后的陽性克隆溫度誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和免疫學(xué)鑒定正確后，純化包涵體，進(jìn)行蛋白的變性、復(fù)性，

2、復(fù)性后蛋白再經(jīng)離子交換和分子篩進(jìn)行純化，得到純品G-CSF，薄層掃描儀掃描凝膠以檢測純度。用PEG20k單修飾G-CSF，修飾產(chǎn)物PEG-G-CSF經(jīng)離子交換和分子篩進(jìn)行純化，得到純品PEG-G-CSF，HPLC檢測純度。測定修飾前后的G-CSF體內(nèi)外生物學(xué)活性。 結(jié)果：經(jīng)PCR鑒定證明所構(gòu)建質(zhì)粒為pJGW-2-G-CSF重組質(zhì)粒，SDS-PAGE證實(shí)表達(dá)后所獲得的融合蛋白分子量為19KD，表達(dá)量約占菌體總蛋白的40％，以不溶

3、的包涵體形式存在。Western blot印跡表明目的蛋白具有人G-CSF的抗原性。純化后產(chǎn)物SDS-PAGE電泳后經(jīng)凝膠掃描儀掃描純度為95％。在G-CSF：PEG(mg/mg)為1:6，pH6.0，反應(yīng)時(shí)間為48h，室溫下進(jìn)行修飾反應(yīng)時(shí)，G-CSF的單PEG修飾度最高，PEG-G-CSF達(dá)到45％左右。經(jīng)純化后獲得純度大于95％的PEG-G-CSF。修飾前G-CSF的體外生物學(xué)活性為1.0x108μ/mg，修飾后G-CSF。的為2.

4、0x107μ/mg。經(jīng)修飾，G-CSF的體外生物學(xué)活性下降，但在小鼠體內(nèi)的作用時(shí)間延長，同時(shí)顯著增強(qiáng)了G-CSF在小鼠體內(nèi)血漿中白細(xì)胞的增殖。 結(jié)論：成功構(gòu)建pJGW-2-G-CSF表達(dá)載體，在大腸桿菌中獲得表達(dá)，獲得包涵體復(fù)性后的純化蛋白。建立了PEG-G-CSF的生產(chǎn)工藝；純化的G-CSF經(jīng)PEG單修飾并純化得到純度大于95％的PEG-G-CSF。初步證明，經(jīng)PEG單修飾后，G-CSF的體外生物學(xué)活性下降，但在小鼠體內(nèi)的作