大熊貓基因組BAC文庫及Ⅱ類MHC基因組物理圖譜構(gòu)建.pdf

1、大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)是我國特有的珍稀瀕危野生動物。長期以來,棲息地片段化和種群數(shù)量下降,致使其野外僅分布于秦嶺、岷山、邛崍、大相嶺、小相嶺和涼山等6個相互隔離的山系,并分化為兩個獨立的亞種——秦嶺亞種和指名亞種。 為搶救性的保護大熊貓這一珍稀瀕危物種,我國政府于2003年啟動了大熊貓的離體保護工程。該工程的主要內(nèi)容之一,就是通過建立大熊貓的基因組DNA文庫,達到保護其遺傳資源,并為相關(guān)的基礎(chǔ)科學(xué)

2、研究提供基因材料平臺的目的。 本論文以細(xì)菌人工染色體(BAC)為載體,建立了高容量的大熊貓基因組DNA文庫。進一步地,通過對大熊貓II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)基因組物理圖譜的構(gòu)建,既驗證了該文庫的有效性,又對文庫進行了基礎(chǔ)研究的應(yīng)用,達到了立題目的。其主要研究結(jié)果如下： 1.以新鮮外周血為材料,利用pCC1BAC載體,成功構(gòu)建了大熊貓的基因組細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫。文庫包含的205,800個BAC克隆,保存

3、于2,100塊96孔培養(yǎng)板上。經(jīng)對隨機挑取的174個BAC克隆進行脈沖電泳檢測,計算出文庫的平均插入片段為97kb,覆蓋大熊貓基因組約6.8倍(除去5.74％的空載體)。同時,從文庫中獲得任一單拷貝或多拷貝大熊貓基因的概率為99.93％。 2.16對PCR引物平均每對能夠在文庫中成功擴增到6.4個陽性克隆,表明了所建文庫具有較高的覆蓋率。 3.運用4D-PCR文庫篩選技術(shù),建立了大熊貓基因組BAC文庫的高效PCR篩選文庫

4、。該文庫包括43個超級庫和1462(43×34)個1D、2D、3D、4D超級亞庫。任一引物或探針只需77個PCR反應(yīng),即可從BAC文庫中篩選到所需的陽性BAC克隆。 4.以大熊貓皮膚成纖維細(xì)胞為材料,運用染色體熒光原位雜交(FISH)技術(shù),成功地將大熊貓的MHC II類基因組定位于第9號染色體的長臂上。 5.通過GenBank數(shù)據(jù)庫中的同源序列,設(shè)計了10對大熊貓MHC II類基因的特異性引物,并成功擴增到了大熊貓Ⅱ類M