轉(zhuǎn)錄因子Gln3、Stp1調(diào)控白念珠菌自噬及耐受雷帕霉素的機(jī)制研究.pdf

1、白念珠菌是臨床免疫力低下患者最容易感染的一種條件致病菌，且致死率極高，這與白念珠菌在宿主內(nèi)的高適應(yīng)性有關(guān)。而且這種高適應(yīng)性也使白念珠菌極易產(chǎn)生耐藥性，這也是臨床上對(duì)白念珠菌感染治療失敗的主要原因之一。已有的研究表明，白念珠菌在宿主體內(nèi)的高適應(yīng)性與其染色體、基因組的不穩(wěn)定性，生物被膜的形成，形態(tài)的改變等密切相關(guān)。但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的機(jī)制也難以完全解釋白念珠菌的高適應(yīng)性和高耐藥性。
　　近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，不同的轉(zhuǎn)錄因子參與了對(duì)白念珠

2、菌適應(yīng)性和耐藥性的調(diào)控。本課題擬利用白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子缺失菌庫(kù)，篩選發(fā)現(xiàn)調(diào)控白念珠菌適應(yīng)性和耐藥性的新的轉(zhuǎn)錄因子，并研究其機(jī)制。因此，本課題利用48株白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子缺失菌，篩選其對(duì)不同抗真菌藥物、化合物、以及酸堿、滲透壓等不同刺激的敏感性，發(fā)現(xiàn)了一批可能影響白念珠菌不同表型的轉(zhuǎn)錄因子。
　　其中Gln3△/△和Stp1△/△對(duì)雷帕霉素高度耐受，而雷帕霉素結(jié)合蛋白TOR是白念珠菌自噬調(diào)控通路中的關(guān)鍵蛋白，因此推測(cè)，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能

3、參與了對(duì)白念珠菌自噬的調(diào)控。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞在饑餓應(yīng)答及分化等過(guò)程中發(fā)生的適應(yīng)性反應(yīng)，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，但目前鮮見對(duì)白念珠菌自噬的研究。因此，本課題利用上述基因缺失菌，研究Gln3和Stp1是否參與調(diào)控白念珠菌自噬，并考察其可能的調(diào)控機(jī)制。
　　已有研究表明，在正常培養(yǎng)條件下，細(xì)胞內(nèi)存在胞質(zhì)定向液泡通路（CVT通路），該通路與自噬發(fā)生的過(guò)程存在著相似性，并且有研究發(fā)現(xiàn)，CVT通路缺陷的菌體，其自噬通路也存在缺陷。在CVT通

4、路和自噬通路缺陷的菌體中，由于自噬小體與液泡融合受阻，細(xì)胞表面部分區(qū)域會(huì)呈現(xiàn)圓形凹陷。因此本實(shí)驗(yàn)利用干涉相差顯微鏡(DIC)觀察比較YPD培養(yǎng)基中Gln3△/△、Stp1△/△和親本菌SN250的細(xì)胞表面，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)親本菌SN250和Gln3△/△的細(xì)胞的表面有圓形凹陷，而Stp1△/△的大部分細(xì)胞表面呈圓形凹陷，表明Stp1△/△的CVT通路缺陷。而經(jīng)RAPA誘導(dǎo)后，Gln3△/△和Stp1△/△的大部分細(xì)胞表面呈圓形凹陷，而SN2

5、50表面凹陷的細(xì)胞較少。表明Gln3△/△和Stp1△/△存在自噬缺陷。
　　自噬的發(fā)生通常由自噬相關(guān)基因(ATG)的表達(dá)增高引起。因此，本課題通過(guò)Realtime-PCR檢測(cè)了不同ATG在mRNA水平上的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)RAPA的確能夠使菌體TOR1、ATG等自噬相關(guān)基因的表達(dá)升高，而且大部分基因的升高幅度達(dá)10倍以上，Gln3△/△和Stp1△/△兩株缺失菌在RAPA作用后，上述自噬相關(guān)基因雖然也能升高，但升高幅度只在2～3倍左

6、右。上述結(jié)果表明，RAPA不能有效誘導(dǎo)Gln3△/△和Stp1△/△中的自噬相關(guān)基因的表達(dá)，所以使上述缺失菌出現(xiàn)自噬缺陷。
　　為了進(jìn)一步考察驗(yàn)證Gln3和Stp1對(duì)白念珠菌自噬的調(diào)控作用，本課題構(gòu)建了Gln3△/△+AB和Stp1△/△+AB兩株轉(zhuǎn)錄因子缺失菌的基因回復(fù)菌，并對(duì)其基因型進(jìn)行了鑒定。同時(shí)考察回復(fù)菌對(duì)雷帕霉素（RAPA）的敏感性，發(fā)現(xiàn)Gln3△/△+AB對(duì)RAPA的敏感性增加，但Stpl△/△+AB并對(duì)RAPA的敏感

7、性并沒(méi)有增加，這有可能與異位單拷貝基因回復(fù)有關(guān)。
　　液泡蛋白氨基肽酶(API)被認(rèn)為是CVT通路的標(biāo)志性蛋白。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)，胞質(zhì)中的50kD的API前體通過(guò)CVT通路運(yùn)向液泡，在液泡中活化，轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腁PI。但處于有限營(yíng)養(yǎng)或饑餓環(huán)境時(shí)，API主要通過(guò)自噬小體運(yùn)向液泡。因此，在營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)，可以通過(guò)定位GFP標(biāo)記的API是否進(jìn)入液泡，來(lái)考察CVT通路是否缺陷。
　　經(jīng)過(guò)構(gòu)建API和綠色熒光蛋白融合蛋白表達(dá)菌體(GFP-API

8、)，可以定位觀察API在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。在RAPA作用后，同時(shí)，也觀察到Gln3△/△和Stp1△/△胞漿及液泡邊緣明顯存有API前體，并未進(jìn)入液泡。由于上述結(jié)果表明Stp1△/△中Cvt通路缺陷，對(duì)此結(jié)果用western-blot在蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證API-GFP前體蛋白的是否被降解，Western結(jié)果表明，Stp1△/△中有80kD的未成熟的API-GFP前體蛋白。這說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子Stp1調(diào)控CVT通路基因表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子Stp1缺失，

9、Cvt通路缺陷。并且轉(zhuǎn)錄因子Gln3和Stp1調(diào)控白念珠菌自噬，轉(zhuǎn)錄因子Gln3和Stp1缺失，自噬缺陷。具體的分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　誘導(dǎo)自噬發(fā)生常通過(guò)氮饑餓方式，利用缺氮培養(yǎng)基SD-N(含Arg)同時(shí)誘導(dǎo)親本菌SN250和基因缺失菌Gln3△/△和Stp1△/△，基因回復(fù)菌Gln3△/△+AB和Stp1△/△+AB自噬。在點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)中SD-N培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并無(wú)差異，但是，當(dāng)在加入RAPA后，增強(qiáng)了其在缺氮培養(yǎng)基上的生存能

10、力。另外，在SD-N(含Arg)誘導(dǎo)的自噬中，發(fā)現(xiàn)以上5株實(shí)驗(yàn)菌株中，液泡內(nèi)均有自噬小體。這說(shuō)明，Gln3△/△和Stp1△/△能夠在氮源誘導(dǎo)的情況下發(fā)生自噬。在SD-N(含Arg)培養(yǎng)基中觀察API定位情況的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與其余4株實(shí)驗(yàn)菌體相比，在Gln3△/△液泡內(nèi)僅有少部分成熟的API。我們繼續(xù)對(duì)5株實(shí)驗(yàn)菌體對(duì)SD-N(含Arg)的耐受性進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)Gln3△/△明顯對(duì)氮饑餓較為敏感。綜上結(jié)果說(shuō)明，轉(zhuǎn)錄因子Gln3參與調(diào)控自噬，轉(zhuǎn)

11、錄因子Gln3在參與調(diào)控SD-N誘導(dǎo)的自噬中起著重要的作用，并且可能對(duì)增強(qiáng)自噬起到正調(diào)控作用。
　　研究至此，明顯發(fā)現(xiàn)，以上實(shí)驗(yàn)菌珠被SD-N(含Arg)誘導(dǎo)的自噬表型，與RAPA誘導(dǎo)的自噬表型并不相同。所以，我們?cè)噲D找出菌體耐受RAPA的調(diào)控機(jī)制。以上5株實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)RAPA誘導(dǎo)后，胞內(nèi)ATP均增加。所以推測(cè)是有氧呼吸產(chǎn)生ATP環(huán)節(jié)，在耐受RAPA中起著重要的作用。因此，將全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基YPD中的葡萄糖更換成檸檬酸、甘油等需通過(guò)不同

12、呼吸方式產(chǎn)生ATP并加以利用的碳源。結(jié)果顯示，以上5株實(shí)驗(yàn)菌體在檸檬酸替換YPD中的葡萄糖培養(yǎng)基中，對(duì)RAPA誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗性。在三羧酸循環(huán)(TCA)中，丙酮酸羧化酶將丙酮酸羧化后形成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰輔酶A經(jīng)檸檬酸合酶催化后形成檸檬酸。首先，推測(cè)可能是檸檬酸的合成受阻。根據(jù)以上研究結(jié)果，我們推測(cè)RAPA誘導(dǎo)的自噬中，Gln3△/△和，Stp1△/△發(fā)生自噬缺陷，使得三羧酸循環(huán)(TCA)中檸檬酸合酶不能進(jìn)入液泡內(nèi)進(jìn)行降解，使得菌體不

13、斷產(chǎn)生ATP加以利用，從而對(duì)RAPA產(chǎn)生了耐藥性。經(jīng)過(guò)構(gòu)建檸檬酸合酶(CIT1p)綠色熒光融合蛋白GFP-CIT1p菌體，觀察CIT1p定位發(fā)現(xiàn)，在RAPA誘導(dǎo)后的以上5株實(shí)驗(yàn)菌株中，Gln3△/△、Stp1△/△和Stp1△/△+ AB中的CIT1p位于液泡外部，而液泡內(nèi)并不存在。所以，初步驗(yàn)證了我們的推測(cè)，RAPA誘導(dǎo)的自噬中，Gln3△/△和Stp1△/△自噬缺陷，使得三羧酸循環(huán)(TCA)中檸檬酸合酶不能進(jìn)入液泡內(nèi)進(jìn)行降解，使得菌