PICK1 PDZ結(jié)構(gòu)域配體的篩選.pdf

1、PICK1全稱為蛋白激酶Cα相互作用蛋白(Protein Interacting with CKinase)，普遍存在于人和動(dòng)物的各種細(xì)胞和組織內(nèi)，小鼠來源的PICK1蛋白由416個(gè)氨基酸殘基組成，主要由N端的PDZ結(jié)構(gòu)域和C端的BAR結(jié)構(gòu)域組成，還有兩個(gè)末端的酸性氨基酸區(qū)和連接區(qū)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種蛋白能與PICK1的PDZ結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用，在突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、外周神經(jīng)感覺、細(xì)胞生生長(zhǎng)等方面發(fā)揮重要作用，并且與精神分裂癥、疼痛、帕

2、金森綜合癥、男性不育癥、抑郁以及癌癥等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，PICK1的PDZ結(jié)構(gòu)域是一個(gè)潛在的藥物靶標(biāo)，藥物分子物質(zhì)可以通過與PICK1的PDZ結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合，干擾或阻斷PICK1與配體蛋白的天然相互作用，從而起到治療相關(guān)疾病的目的。
　　 我國的中草藥資源豐富，具有療效好，副作用少，適合長(zhǎng)期服用及安全可靠等許多優(yōu)點(diǎn)，在防治和治療各種疾病中起到了重要作用。近年來，從中藥中提取有效成分在新藥和新藥先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮

3、著重要作用。本文圍繞PICK1的PDZ結(jié)構(gòu)域開展以下工作。首先將含PICK1基因及PDZ編碼基因的重組質(zhì)粒pET3 a-pick1和pET-3C-GB-pdz轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌中獲得重組表達(dá)，目的蛋白經(jīng)硫酸銨沉淀或Ni2+-NTA Sepharose4B column親和層析，再經(jīng)Sephacryl S-200凝膠層析純化獲得電泳純的PICK1和GB-PDZ蛋白。進(jìn)一步針對(duì)PICK1-PDZ

4、結(jié)構(gòu)域中相關(guān)位點(diǎn)做如下定點(diǎn)突變，K27D28/AA，K83/A，I33G34I35/AAA并克隆至載體pETM-3C或pET-MG-3C中，并在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行重組表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA Sepharose4B column親和層析和Sephacryl S-200凝膠層析獲得電泳純的重組PDZ突變體蛋白。
　　 其次利用熒光光譜法分析了3種中藥（款冬花，酸棗仁和茯苓）粗提物與PICK1及其不同結(jié)構(gòu)域

5、的結(jié)合情況，結(jié)果表明3種中藥粗提物中的款冬花提取物與PICK1的結(jié)合最強(qiáng)，并且結(jié)合位點(diǎn)位于N端的PDZ結(jié)構(gòu)域;通過系統(tǒng)溶劑萃取法將款冬花提取物分離為6種有機(jī)相提取物，熒光光譜法結(jié)果表明乙酸乙酯和正丁醇提取物與PICK1的PDZ結(jié)構(gòu)域有明顯的相互作用;進(jìn)一步確定款冬花中蘆丁與PICK1的PDZ結(jié)構(gòu)域有明顯的相互作用。用PICK1 PDZ結(jié)構(gòu)域的不同突變體蛋白與蘆丁進(jìn)行熒光光譜分析，結(jié)果表明PICK1 PDZ結(jié)構(gòu)域的不同突變體蛋白與蘆丁之間