缺氧預(yù)處理MSCs移植對心肌梗死區(qū)SDF-1-CXCR4軸表達變化的實驗研究.pdf

1、目的：研究骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)及缺氧預(yù)處理MSCs在SD大鼠急性心肌梗死模型梗死局部注射后梗死區(qū)域基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4表達變化以及對梗死后心功能改善的作用,并對其機理及意義進行探討。
　　 方法：全骨髓法分離培養(yǎng)SD大鼠MSCs,通過體外培養(yǎng)和連續(xù)傳代達到純化和擴增MSCs目的。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化情況;利用四唑鹽比色法(MTT)測定MSCs的生長曲線;流式細胞儀(FCM)鑒定MSCs膜

2、抗原。其中部分MSCs在術(shù)前24h作預(yù)缺氧處理,體外實驗分別測定普通培養(yǎng)MSCs和預(yù)缺氧培養(yǎng)MSCs中的SDF-1和CXCR4含量。128只SD大鼠,隨機分為MSCs移植組(MSCs組,n=32)、缺氧預(yù)處理MSCs移植組(預(yù)處理MSCs組,n=32),結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備急性心肌梗死模型,結(jié)扎左前降支冠狀動脈10min后,在梗死區(qū)域、梗死區(qū)邊緣局部注射共約0.5×106uL-1個MSCs和預(yù)缺氧處理后的MSCs。取32只為對照組,

3、僅結(jié)扎左前降支冠狀動脈。其余32只SD大鼠作為假手術(shù)組。心肌梗死前及梗死后28d采用超聲心動圖測量LVDd、LVDs、EF三項反應(yīng)心臟功能指標(biāo)。分別于術(shù)后1d、7d、14d和28d每組各處死8只大鼠取心臟組織作免疫組化、RT-PCR、常規(guī)病理染色等項目檢查。測定不同時期SDF-1/CXCR4在各組梗死心肌局部表達值的變化,同時測定心肌梗死面積、梗死區(qū)心室壁厚度和心室肌內(nèi)微血管密度。
　　 結(jié)果：成功培養(yǎng)MSCs,取第4代MSCs

4、進行FCM檢測,CD45、CD90、CD29陽性率分別為1.50％、99.18％、97.70％。MSCs體外試驗顯示有SDF-1mRNA和CXCR4mRNA表達,其中SDF-1mRNA缺氧預(yù)處理組表達是正常MSCs的1.20倍,而CXCR4mRNA表達值是正常MSCs組的1.47倍。MSCs體外SDF-1和CXCR蛋白熒光定量SDF-1低氧組為108.54±1.79,正常組為26.08±1.28(P＜0.05);CXCR4低氧組為135

5、.50±1.19,正常組為28.13±1.02(P＜0.05)。成功建立SD大鼠急性心肌梗死模型,手術(shù)存活率為95％。免疫組織化學(xué)及激光共聚焦顯示,移植MSCs后SDF-1和CXCR4在梗死周邊區(qū)域注射細胞處及局部血管壁發(fā)生高表達,且SDF-1mRNA、CXCR4mRNA在移植后24h后達高峰,持續(xù)約7d,以后逐漸遞減;SDF-1、CXCR蛋白熒光定量在移植后7d達高峰,以后逐漸遞減。其中預(yù)處理MSCs組SDF-1和CXCR4的表達在有

6、各時間點又均顯著高于MSCs組(P＜0.05)對照組心梗后SDF-1和CXCR4值升高,與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P＜0.05),假手術(shù)組心肌組織中有SDF-1和CXCR4的少量表達。心肌梗死后28d時超聲心動圖結(jié)果表明MSCs組和預(yù)處理MSCs組LVDd、LVDs、EF三項反應(yīng)心臟功能指標(biāo)均較對照組明顯改善(P＜0.05),其中預(yù)處理MSCs組又顯著優(yōu)于MSCs組(P＜0.05)。與對照組比較,梗死面積縮小程度最顯著為預(yù)處理MSCs

7、組,其次為MSCs組,三者之間均有顯著差異(P＜0.05)。左室前壁厚度在預(yù)處理MSCs組、MSCs組和對照組依次為3.56±0.45mm、2.88±0.32mm和1.80±0.71mm,各組間差異均有顯著性(P＜0.05)。心肌梗死區(qū)、心肌梗死邊緣區(qū)及正常心肌組織三個部位CD31新生微血管數(shù)量測定MSCs組和預(yù)處理MSCs組均較對照組明顯增加(P＜0.05),其中預(yù)處理MSCs組又顯著高于MSCs組(P＜0.05)。
　　 結(jié)

8、論：全骨髓貼壁法能有效得到分離純化的MSCs,MSCs生長穩(wěn)定,增殖能力活躍,具有MSCs的一般生物學(xué)特性,可以作為組織工程理想的種子細胞。MSCs在體外普通或缺氧兩種方法培養(yǎng)條件下SDF-1/CXCR4均有表達,且缺氧預(yù)處理組高于正常培養(yǎng)組,說明缺氧條件能促進MSCs高表達SDF-1和CXCR4。MSCs在心肌梗死區(qū)域注射后可提高局部組織內(nèi)SDF-1和CXCR4表達,而經(jīng)預(yù)缺氧處理MSCs移植后局部SDF-1和CXCR4表達最高,SD

9、F-1和CXCR4在心肌梗死區(qū)域局部的高表達可能會誘導(dǎo)外周血、骨髓內(nèi)及其他組織中干細胞向心肌梗死區(qū)域轉(zhuǎn)移,促進新生毛細血管,這可能是MSCs治療急性心肌梗死的機制之一,也可能是缺氧預(yù)處理MSCs改善心功能更好的原因之一。未移植MSCs心肌梗死組中梗死區(qū)域局部也有一定SDF-1/CXCR4表達升高,這可能是心肌梗死后機體調(diào)動外周干細胞定向遷移參與損傷心肌修復(fù)的途徑之一。在將來的缺血性心臟病基礎(chǔ)及臨床研究中,可能通過調(diào)控局部SDF-1/CX